张文晓;秦宜德;
摘要:
目的构建并鉴定牛乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽(简称LIFP)基因的重组载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达和纯化,获得较高纯度的融合肽;研究LIFP基因体外对卵巢癌细胞SKOV3的影响,为基因治疗卵巢癌提供基础。方法以GENBANK报道的牛乳铁蛋白抗菌肽(LFCINB)与乳源免疫调节肽(PGPIPN)的序列为参照,以连接臂GGGGS连接两种肽,合成融合肽LIFP基因,并在其5’端加入凝血酶FXA识别的酶切位点。将LIFP基因构建到表达载体PGEX-KG中,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后,采用最优表达条件诱导重组载体在大肠杆菌BL21中表达,超声裂菌后,SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白(LIFP-GST),通过AKTA层析系统纯化融合蛋白,FXA酶切后,高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)鉴定LIFP的表达;将LIFP基因构建到PLJM1载体[含CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)中,获得PLJM1-LIFP慢病毒表达载体,经PCR检测及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LIPOFEETAMINE 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度;体外培养人卵巢癌细胞SKOV3,重组慢病毒感染细胞后,MTT法观察融合肽对SKOV3细胞的生长抑制作用,HOECHST33258染色观察细胞核形态的变化。结果PCR和测序证实成功构建了PGEX-KG-LIFP重组载体;WESTERN-BLOT结果显示成功诱导LIFP的高表达;HPLC显示获得较高纯度LIFP;MS显示氨基酸序列与目的肽一致;成功构建PLJM1-LIFP慢病毒表达载体,三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1.2×108TU/ml;重组病毒感染SKOV3细胞后,MTT结果显示融合肽对体外培养的SKOV3细胞生长具有抑制作用(P<0.05),荧光显微镜观察到凋亡细胞典型的形态学特征。结论成功诱导表达纯化融合肽,并初步证实对体外SKOV3有生长抑制和诱导细胞凋亡作用。
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