本研究为病例对照研究，共招募了38例参与者，包括在安徽医科大学第一附属医院和安徽医科大学第二附属医院皮肤科就诊的20例重症AA患者和来自健康体检中心的18例健康对照者。所有参与者均签署知情同意书，获得了安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（PJ2023-14-82）。AA患者纳入标准为脱发严重程度评分工具（severity of alopecia tool， SALT）≥ 50%（即脱发面积≥头皮面积 50%）；表现为头皮圆形/椭圆形脱发斑；病变处于活动期（脱发斑边缘存在“惊叹号发”或拉发试验阳性）。健康对照者纳入标准为无斑秃及其他皮肤病史，头皮无可见病变。使用无菌棉拭子分别采集AA活动性脱发斑中心（AA组）；距脱发斑≥5 cm的未脱发部位（AAn组）和健康对照者的枕部（Con组）。样本采集后立即置于DNA保存液，-80 ℃保存直至DNA提取。

所有参与者采样前48 h内禁止洗发（确保头皮微生态恢复稳态）；洗发产品统一提供无抗真菌成分的中性洗发露（pH = 5.5），采样前最后一次洗发必须使用该产品；口头指导参与者按标准流程洗发（水温 37 ℃±2 ℃，揉搓时间 ≤3 min，彻底冲洗），以最大程度减少清洁因素对真菌群落的干扰。

采用MagPure Soil DNA LQ Kit （Magan） 试剂盒并参照说明书对样本基因组DNA进行提取。利用NanoDrop2000 （Thermo Fisher Scientific，美国） 和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，将提取的DNA保存于-20 ℃。以提取的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物和Takara Ex Taq高保真酶进行真菌ITS基因的两轮PCR扩增。采用通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）扩增ITS基因ITS1可变区，用于真菌多样性分析。一轮PCR（目标片段扩增，30 μL体系）：2×Gflex Buffer （15 μL） + 引物ITS1F/ITS2 （各1 μL，5 pmol/μL） + 模板DNA （≥ 50 ng） + 酶 （0.6 μL） + ddH₂O （补至30 μL）； 程序：94 ℃ 5 min预变性；26 循环（94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s退火 → 72 ℃ 20 s）；72 ℃ 5 min终延伸。二轮PCR（加测序接头，30 μL体系）：2×Gflex Buffer （15 μL） + 酶 （0.6 μL） + Adapter I5/I7 （各1 μL + 一轮产物 （50 ng） + ddH₂O （补至30 μL）；程序：94 ℃ 5 min预变性；7循环（94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s退火 → 72 ℃ 20 s）；72 ℃、5 min终延伸。扩增产物经AMPure XP beads纯化后建库测序。

PCR扩增产物使用电泳检测。然后使用AMPure XP beads磁珠纯化，纯化后作为二轮 PCR模板，并进行二轮PCR扩增。并再次使用磁珠纯化，取纯化过的二轮产物进行 Qubit定量，然后调整浓度进行测序。使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序，并生成250 bp的双端读段。

数据下机后，首先使用Cutadapt软件，将raw data序列剪切掉引物序列。然后使用分区扩增子降噪算法2（divisive amplicon denoising algorithm 2，DADA2）将上一步合格的双端raw data按照微生物生态学定量洞察软件2（quantitative insights into microbial ecology 2，QIIME 2）默认参数进行质量过滤、降噪、拼接及去嵌合体等质控分析，得到代表序列及ASV丰度表格。使用QIIME 2软件包挑选出各个扩增子序列变体（amplicon sequence variants， ASV）的代表序列后，将所有代表序列与Unite数据库进行比对注释。物种比对注释使用q2-feature-classifier软件默认参数进行分析。

本研究所有统计分析均通过R语言（v4.2.0）及 QIIME 2（v2022.11）平台完成。对于基线资料分析分类变量（如性别）采用卡方检验（χ²）进行组间比较；连续变量（如年龄）经 Shapiro-Wilk 正态性检验后，符合正态分布者采用独立样本 t 检验，不符合正态分布者采用 Mann-Whitney U 检验。三组间比较使用 Kruskal-Wallis 检验，组间两两比较采用 Dunn′s post-hoc 检验，并使用 Benjamini-Hochberg 法进行多重检验校正。利用Unweighted UniFrac 距离矩阵进行主坐标分析（PCoA），并通过 PERMANOVA（Adonis 算法，999 次置换）检验组间差异，计算β多样性。物种组成差异分析：在门（Phylum）和属（Genus）水平进行相对丰度比较，首先进行 Shapiro-Wilk 正态性检验，非正态分布数据采用非参数检验：两组比较使用 Wilcoxon 秩和检验，三组比较使用 Kruskal-Wallis 检验。多重检验校正采用 Benjamini-Hochberg 法控制错误发现率（FDR）。生物标志物筛选采用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）方法进行差异物种筛选，参数设置为 Kruskal-Wallis 检验 P0.05，LDA Score3.0，以识别组间差异有统计学意义的分类单元；数据转换与软件工具：非正态分布数据在分析前进行 Log₁₀（x+1） 转换。本研究设定显著性水平（α）为0.05，即P0.05表示差异有统计学意义。

研究共纳入38例受试者，包括20例重症AA患者（其中脱发面积 50%者12例，全秃1例，普秃7例）和18例健康对照者。病例组中男性7例，女性13例，平均年龄（34.1±7.35）岁，平均病程（6.75±4.97）年；对照组中男性8例，女性10例，平均年龄（29.06±8.56）岁。两组在性别构成（χ²=0.354，P=0.552）和年龄（t=1.954，P=0.058）方面差异均无统计学意义。重症AA患者及普秃患者的典型临床表现和皮肤镜特征见图1。

通过α多样性分析展示不同分组中真菌群落的多样性和丰富度，Chao1指数和ACE指数检测到AA组物种丰富度显著高于Con组（P0.01），见图2A、2B，在Shannon和Simpson多样性指标中，AA组多样性显著高于Con组（P0.01），见图2C、2D；在Observed species指标中，AA组实际观察到的物种数量显著高于Con组（P0.01），见图2E；Good′s Coverage指标中所有组别的覆盖度都非常高，接近1，表明测序深度足够覆盖所有物种，见图2F。

为解析不同组别间真菌群落的整体结构差异，整合了非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和系统发育树分析。AA组与AAn组样本聚集紧密（Stress=0.085），表明两组真菌群落结构相似。Con组样本明显分离于AA/AAn组（PERMANOVA，R²=0.317，P=0.001），提示AA患者与健康人群存在显著真菌群落差异，见图3A。系统发育树分析显示，AA组以子囊菌门（Ascomycota）（相对丰度62.1%±8.7%）为主导进化谱系，并富集环境真菌球壳孢属（Mycosphaerella）/曲霉属（Aspergillus）分支长度 15%，而Con组的核心类群为马拉色菌属（Malassezia）（分支长度占比48.3%±6.2%）；同时，AA组与Con组间的进化距离（0.41±0.06）大于AA组与AAn组间的距离（0.19±0.03）（P0.001），见图3B。

对3组样本在门和属水平的真菌组成分析表明，其群落结构存在差异（图4A、4B）。在门水平上，担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）为共同优势菌门。进一步比较显示，子囊菌门在AA组中的相对丰度显著高于AAn组和Con组（P0.01）（图4C）。在属水平上，马拉色菌属（Malassezia）在各组中均占主导地位。组间比较显示，球壳孢属（Mycosphaerella）（P0.05）、曲霉属（Aspergillus）（P0.01）、青霉属（Penicillium）（P0.000 1）和华勒菌属（Wallemia）（P0.05）在AA组的相对丰度显著高于AAn组和Con组；而阿克雷蒙菌属（Acremonium）和裂褶菌属（Schizophyllum）则在AAn组中显著富集（P0.05）（图4D）。此外，真菌群落整体呈现长尾分布特征，AA组中富集的相关菌属多位于高丰度区间（图4E）。