YIKE安徽医科大学学报Acta Universitatis Medicinalis AnhuiActa Universitatis Medicinalis Anhui安徽医科大学学报1000-149234-1065/RAnhui Lianzhong Printing Limited CompanyEditorial Board of Acta Universitatis Medi-cinalis Anhui Meishan Road , Hefei 230032《安徽医科大学学报》编辑部安徽省合肥市安徽医科大学校内老图书馆三楼1000–1492（2026）03–0409–0710.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004V210吴瑶瑶R 593.22A基础医学研究C-C趋化因子受体6基因敲除小鼠的构建及鉴定Construction and identification of C-C motif chemokine receptor type 6 gene knockout mice吴瑶瑶WuYaoyao张蕊ZhangRui魏伟WeiWei安徽医科大学药学科学学院，临床药理研究所，合肥 230032Institute of Clinical Pharmacology，School of Pharmaceutical Sciences， Anhui Medical University，Hefei 230032

吴瑶瑶，女，硕士研究生

张 蕊，女，副教授，硕士生导师，通信作者，E-mail：zhangrui@ahmu.edu.cn

魏 伟，男，教授，博士生导师，通信作者，E-mail：wwei@ ahmu.edu.cn

Zhang Rui， E-mail： zhangrui@ahmu.edu.cnWei Wei， E-mail：wwei@ahmu.edu.cn060220262303202661314409415409-415 06122025 目的

构建C-C趋化因子受体6（CCR6）基因纯合敲除小鼠模型，为后续开展体内功能研究奠定关键的动物模型基础。

方法

采用规律成簇间隔短回文重复序列及其关联蛋白9系统（CRISPR/Cas9）技术构建Ccr6-/-小鼠。提取鼠尾基因组DNA，通过PCR并结合琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型鉴定；应用HE染色观察小鼠的心脏、肝脏、肺及肾脏等主要组织器官的病理学形态；利用Western blot检测小鼠血液、脾脏和骨髓中CCR6蛋白的表达水平；通过流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和巨噬细胞的比例，以分析CCR6基因敲除对主要免疫细胞群体比例的影响。

结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，经引物鉴定，仅在307 bp位置扩增出单一特异性条带的小鼠即为Ccr6-/-小鼠；HE染色观察显示，Ccr6+/+小鼠与Ccr6-/-小鼠主要组织器官的细胞形态未见明显差异；Western blot分析表明，Ccr6-/-小鼠主要组织中CCR6蛋白表达基本缺失，敲除效果良好；流式细胞术分析结果表明，CCR6基因缺失可显著增加CD8+T细胞的比例，而CD4+T细胞和巨噬细胞的比例保持不变。

结论

成功利用CRISPR/Cas9技术构建了CCR6基因纯合敲除小鼠模型，为深入开展CCR6的体内功能机制研究提供了稳定可靠的动物模型基础。

Objective

To establish a C-C motif chemokine receptor 6 （CCR6） homozygous knockout mouse model in order to provide a crucial animal model foundation for subsequent in vivo functional studies.

Methods

Ccr6-/- mice were generated using CRISPR-Cas9 technology. Genomic DNA was extracted from mouse tails， with genotyping performed by PCR and agarose gel electrophoresis. Pathological morphology of major organs （heart， liver， lung， kidney） was assessed through HE staining. Western blot was used to analyze CCR6 protein expression in blood， spleen， and bone marrow. To analyze the impact of CCR6 gene knockout on the proportion of major immune cell populations， the ratio of T cells and macrophages in the mouse spleen was detected using flow cytometry.

Results

The results of agarose gel electrophoresis demonstrated that mice exhibiting a single specific band at the 307 bp position upon primer-based identification were confirmed as Ccr6-/- mice. HE staining revealed no significant histopathological differences between Ccr6+/+and Ccr6-/- mice. Western blot demonstrated near-complete absence of CCR6 protein in target tissues. Flow cytometry results demonstrated that CCR6 gene deletion significantly increased the proportion of CD8⁺T cells， while the ratios of both CD4⁺T cells and macrophages remained unaltered.

Conclusion

A Ccr6-/- mouse model is established using CRISPR-Cas9 technology， serving as an essential tool for elucidating CCR6′s regulatory role in tumor proliferation.

C-C趋化因子受体6基因敲除CRISPR-Cas9基因型鉴定聚合酶链式反应蛋白表达C-C motif chemokine receptor 6gene knockoutCRISPR-Cas9genotypingpolymerase chain reactionprotein expression国家自然科学基金项目82403663安徽省高校自然科学研究重点项目2024AH050776安徽医科大学校科研基金项目2023xkj013国家自然科学基金项目（编号：82403663）；安徽省高校自然科学研究重点项目（编号：2024AH050776）；安徽医科大学校科研基金项目（编号：2023xkj013）National Natural Science Foundation of China82403663Natural Science Research Project of Anhui Educational Committee2024AH050776Scientific Research Project of Anhui Medical University2023xkj013National Natural Science Foundation of China （No. 82403663）；Natural Science Research Project of Anhui Educational Committee （No. 2024AH050776）；Scientific Research Project of Anhui Medical University （No. 2023xkj013）version1.0.0.25071structure-time2026-05-25T09:36:48word-sourceFX

C-C趋化因子受体6（C-C motif chemokine receptor type 6，CCR6）是一种G蛋白偶联受体，特异性表达于树突状细胞和T淋巴细胞等免疫细胞表面。CCR6的核心功能是通过识别配体C-C趋化因子配体20（C-C chemokine ligand 20，CCL20），介导表达CCR6的免疫细胞定向迁移，参与机体炎症应答和维持免疫稳态［1–3］。由于CCR6在免疫细胞募集中的关键作用，其在类风湿关节炎、银屑病等多种炎症性疾病及肿瘤发生发展中具有重要意义［4–8］。因此，为在整体动物水平上深入研究CCR6的功能及其在疾病中的机制，构建CCR6基因敲除小鼠模型至关重要。建立标准化的基因型鉴定流程与高效的繁育策略，是获得可靠、稳定实验模型的基础。该研究旨在详细阐述CCR6基因敲除小鼠的基因型鉴定方法与繁育策略，为相关科研提供精准可靠的CCR6基因敲除小鼠模型，以深入探究CCR6相关疾病的发生机制。

材料与方法材料实验动物

该研究选用遗传背景为C57 BL/6J的Ccr6+/+及其同窝Ccr6+/- 小鼠各4 只（雌雄各半），均由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供。小鼠体质量范围为20～25 g，生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009。所有动物实验方案均通过安徽医科大学临床药理研究所动物实验伦理委员会批准（编号：PZ-2025-015）。实验动物饲养于安徽医科大学临床药理研究所SPF级动物房内，环境温度维持在22～25 ℃，相对湿度维持在70%左右。

主要试剂

pH=7.4三甲基氨基甲烷-盐酸（Tris aminomethane-Hydrochloric acid ，Tris-HCl）缓冲液（货号：B548138-0500，上海生工生物工程股份有限公司）、 pH=8.0乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液（货号：B540625-0500，上海生工生物工程股份有限公司）、蛋白酶K溶液（货号：B600169-0002，上海生工生物工程股份有限公司）、2× San Taq PCR Mix（货号：B532061-0040，上海生工生物工程股份有限公司）、DNA marker（货号：B500351-0500，上海生工生物工程股份有限公司）、核酸染料（货号：A616696-0100，上海生工生物工程股份有限公司）、琼脂糖（货号：A620014-0100，北京索莱宝生物科技有限公司）；氯化钠（货号：S8210，北京索莱宝生物科技有限公司）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（货号：S8010，北京索莱宝生物科技有限公司）；放射免疫沉淀分析（radio immuno precipitation assay ，RIPA）缓冲液（货号：C500005-0100，上海生工生物工程股份有限公司）、5×蛋白上样缓冲液（货号：P0286，上海碧云天生物技术公司）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride ，PMSF）（货号：ST506，上海碧云天生物技术公司）；50×三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-EDTA ，TAE）缓冲液（货号：G3001， 北京塞维尔生物科技有限公司）；CCR6抗体（货号：PAB12270，上海优宁维生物科技股份有限公司）；β-actin抗体（货号：HC201-02，北京全式金生物技术有限公司）；CD45、CD3、CD4、CD8和F4/80流式抗体（货号：103108、100206、100412、162310、123116，美国Biolegend试剂公司）。qPCR试剂（货号： Q111-02、R223-01，南京诺唯赞生物科技有限公司）；基因鉴定引物均购自上海生工生物工程股份有限公司。

主要仪器

天能Tanon琼脂糖凝胶电泳仪、化学发光凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：EPS-300、Tanon 5200）；通用型电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-6C）；组织原位细胞扫描分析系统（山东济南丹吉尔电子有限公司，型号：Pannoramic MIDI）；Thermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：T100 TM）；全自动凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：Tanon 1600）；高端分析型流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSCanto）。

方法先导RNA载体构建

CCR6基因位于小鼠17号染色体（Gene ID： 12458），包含9个转录本。该研究选定转录本CCR6-201（ENSMUST00000097 418.7）的外显子5和6作为特异性敲除区域，该区域编码长度为367 bp的蛋白质功能域。该区域的精确敲除将导致CCR6蛋白结构完整性破坏及功能丧失。基于此敲除策略，通过规律成簇间隔短回文重复序列及其关联蛋白9系统（CRISPR-Cas9）工具设计了特异性靶向该区域的两条单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）：CCR6-5S1：GCGTGT GGTATAAGCTTACT和CCR6-3S1：ACACGAAACTC TCGGTGACC，分别识别前间区序列邻近基序AGG。后续所有分子操作，包括sgRNA表达载体的构建与优化、载体的线性化处理、产物的纯化以及体外转录等关键实验步骤，均由合作的专业生物技术公司完成。

<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠的获得及繁殖

通过受精卵显微注射技术，将Cas9蛋白与体外转录获得的sgRNA混合物共同注入小鼠受精卵中，并将存活胚胎移植至代孕母鼠子宫内，该步骤由专业生物公司操作完成，最终成功获得阳性F0代杂合子（Ccr6+/-）小鼠。为建立稳定遗传的品系，将经基因型鉴定的F0代小鼠与C57 BL/6J野生型小鼠交配，产生F1代杂合子（Ccr6+/-）小鼠。随后通过F1代杂合子小鼠间的互交，获得F2代纯合子敲除（Ccr6-/-）小鼠。

小鼠基因型鉴定鼠尾基因组DNA提取

取约4周龄小鼠尾尖组织（1～3 mm），置于含有490 µL鼠尾裂解液及10 µL蛋白酶K溶液的无酶EP管中，充分涡旋混匀，55 ℃水浴消化过夜（12～16 h）。消化完成后，将EP管室温冷却片刻，于12 000 r/min 离心15 min。小心吸取200 µL上清液置于新的EP管中，加入400 µL无水乙醇，轻柔颠倒混匀至出现絮状沉淀。12 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，加入400 µL 75%无水乙醇（无酶水∶无水乙醇=1∶3），轻柔颠倒混匀。12 000 r/min 离心5 min，小心弃去上清液。再将离心管以12 000 r/min 短暂离心30 s，用移液枪小心吸弃残留乙醇。离心管开盖室温晾置20～30 min。加入30 µL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 水，轻柔吹打溶解DNA沉淀，溶解后的DNA放入4 ℃冰箱备用。

PCR扩增反应

该研究中使用两对引物，使用的基因鉴定引物序列见表1。PCR反应总体系13 µL：2×San Taq PCR Mix 6.5 µL；ddH2O 4.5 µL；两对引物各0.5 µL；基因组DNA模板1 µL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；35个循环（95 ℃变性15 s；65 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min）；72 ℃、5 min终止反应。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004.T001

Ccr6-/-小鼠基因鉴定引物序列

Primer sequences for<italic> Ccr6<sup>-/-</sup> </italic>mice gene identification
Primer nameSequence （5′⁃3′）
F1TGCCTCACCACACTTTGCTTCT
R1ACACCTTAGTGGGTCCCTCTCTCTA
F2TGCCTCACCACACTTTGCTTCT
R2TGATTCAAAGACTGGAGAGATGGC
琼脂糖凝胶电泳

称取1.4 g琼脂糖粉末置于锥形瓶中，加入70 mL 1×TAE电泳缓冲液，手动混匀。使用微波炉加热至溶液第1次沸腾，取出后小心摇匀。再次放入微波炉加热至第2次煮沸，取出后充分摇匀。待溶液稍冷却后，补充ddH2O定容至初始体积（缓慢加，边加边摇匀，避免局部冷却过快），稍微冲凉冷却到55 ℃左右加入核酸染料，摇匀缓慢倒入已放置好梳子的制胶槽中，直到整个板表面形成均匀胶层，室温下静置20～30 min直至凝胶完全凝固，垂直向上轻拔梳子，即得2%琼脂糖凝胶。取上述PCR扩增产物10 µL电泳，上样时，将DNA Marker 点样于中间泳道，F1R1与F2R2的PCR扩增产物分别点样于Marker两侧的泳道，电压140 V，电泳30 min，使用天能Tanon琼脂糖凝胶电泳仪观察条带。

外周血单个核细胞悬液的制备

使用无菌剪刀小心剪去小鼠面颊部两侧胡须，用无菌镊子迅速摘除眼球，将血液收集到抗凝管中，加入5 mL红细胞裂解液，用移液枪轻柔且充分吹打混匀，室温裂解15 min，确保红细胞充分裂解。加入适量预冷含0.2%FBS的PBS终止裂解，1 500 r/min 离心10 min后，小心弃去上清液，即获得外周血单个核细胞悬液。

脾脏细胞悬液的制备

颈椎脱臼处死小鼠后，无菌摘取小鼠的脾脏组织置于70 µm细胞滤网上，采用机械研磨法配合5 mL注射器的推杆进行组织解离，用预冷的含0.2%FBS的PBS将研磨后的组织冲洗过滤至50 mL离心管中，1 500 r/min 离心5 min后，弃去上清液，加入2 mL红细胞裂解液，用移液枪轻柔且充分吹打混匀，冰上孵育5 min。加入适量预冷的含0.2%FBS的PBS终止裂解，1 500 r/min 离心5 min后，弃去上清液，即获得脾脏细胞悬液。

骨髓细胞悬液的制备

在小鼠后肢髋关节和踝关节处剪断，取下完整的下肢，用镊子配合湿润纱布仔细摩擦剔除附着在骨骼上的肌肉、肌腱和结缔组织。将剥离干净的骨骼在75%乙醇中浸泡30 s进行表面灭菌，随后立即转移至无菌PBS中漂洗2次。将骨骼转移至无菌的6 cm培养皿中，加入少量预冷的含0.2%FBS的PBS使其保持湿润。用无菌剪刀在股骨两端以及胫骨两端各剪开一个小口，充分暴露骨髓腔。用1 mL注射器吸取少量预冷的含0.2%FBS的PBS，将针头对准一端骨腔开口，轻柔且持续地推注PBS，将骨髓从骨腔中冲出至培养皿中，调换骨骼方向，从另一端开口重复冲洗，直至骨骼变白。用移液枪将培养皿中的骨髓细胞悬液转移到15 mL离心管中，用少量预冷的含0.2%FBS的PBS冲洗培养皿并将其合并到离心管中，1 500 r/min 离心5 min后，小心弃去上清液，加入2 mL红细胞裂解液，用移液枪轻柔且充分吹打混匀，冰上孵育5 min。加入适量预冷的含0.2%FBS的PBS终止裂解，1 500 r/min 离心5 min后，弃去上清液，即获得骨髓细胞悬液。

小鼠体质量和重要器官的HE染色

分别称量Ccr6+/+小鼠和Ccr6-/-小鼠体质量后，取心脏、肝脏、肺和肾脏组织经固定、石蜡包埋后切片。切片依次经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（各10 min）脱蜡，梯度乙醇（100%、95%、75%，各5 min）及双蒸水水化。苏木精染色5 min，流水冲洗返蓝；0.1%盐酸乙醇分化数秒后流水冲洗，伊红染色2～5 s，再用流水进行冲洗。脱水透明步骤：75%、95%、100%乙醇（各5 min），二甲苯10 min。中性树脂封片后，采用组织原位细胞扫描分析系统观察病理形态。

CCR6蛋白水平检测

将裂解液（RIPA裂解液196 µL+蛋白酶抑制剂2 µL+磷酸酶抑制剂2 µL）加入细胞中裂解细胞，冰上裂解30 min后，12 000 r/min 离心15 min收集上清液。应用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）检测法测定蛋白浓度，取等量蛋白与5×上样缓冲液混匀，100 ℃恒温煮沸10 min使蛋白变性。制备10%-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，上样后先以80 V恒压电泳至浓缩胶，随后调整为120 V继续电泳至溴酚蓝到达胶底端。采用湿转法（220 mA，90 min）将蛋白转移至PVDF膜。将膜放入5%脱脂牛奶（1 g脱脂奶粉溶于20 mL TPBS）中，室温摇床低速封闭2 h。双蒸水漂洗3 次（每次10 min）后，在条带对应位置敷上β-actin（1∶5 000）和CCR6（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜（16～18 h）。次日，复温至室温后，TPBS清洗3 次（每次10 min）后，随后加入相应二抗（山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG，1∶10 000稀释于5%脱脂牛奶），室温摇床低速封闭2 h。TPBS清洗3 次、PBS清洗1 次（每次10 min）后，采用化学发光凝胶成像分析系统进行显影。使用ImageJ软件定量分析内参和目的条带的灰度值，并对各组结果进行比较。

流式细胞术分析<italic>CCR6</italic>对主要免疫细胞比例的影响

将“1.2.5”项下提取的脾脏细胞悬液移至流式管中，标记好Ccr6+/+组和Ccr6-/-组，1 500 r/min 离心5 min后，小心弃去上清液，两组细胞经固定破膜后，加入相应体积的CD45、CD3、CD4、CD8和F4/80流式抗体，4 ℃避光孵育30 min 后，1 500 r/min 离心5 min后，小心弃去上清液，用300 µL PBS重悬后，经滤网过滤后，上机进行分析。

统计学处理

采用GraphPad Prism 8软件对所有数据进行统计分析，实验结果以均值±标准差（x¯±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P 0.05为差异有统计学意义。

结果<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠的获得

从合作公司获得F1代小鼠后，首先通过PCR及电泳技术对其进行基因型鉴定。结果显示（图1A），所有F1代小鼠（编号1-4）均在307 bp和298 bp位置同时出现特异性条带，证实为Ccr6+/-小鼠。为获得Ccr6-/-小鼠，选取经鉴定的F1代杂合子小鼠进行互交扩繁，获得F2代群体，并对F2代个体进行基因型鉴定。结果如图1B所示，9号小鼠仅显示298 bp条带，为Ccr6+/+小鼠；8号小鼠同时显示307 bp和298 bp条带，为Ccr6+/-小鼠；5、6、7、10、11及12号小鼠仅显示307 bp条带，鉴定为Ccr6-/-小鼠。上述结果表明，利用F1代杂合子小鼠成功扩繁并获得CCR6基因敲除纯合小鼠，且该基因型能够稳定遗传。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004.F001<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠基因鉴定结果Results of gene identification of <italic>Ccr6<sup>-/-</sup> </italic>mice

A： Genotyping results of F1 generation mice；B： Genotyping results of F2 generation mice；1-12：Represent different mouse numbers；P： Positive control；W： Wild Type；M：DNA marker.

<italic>CCR6</italic>敲除对小鼠生长发育的影响

初步观察显示，CCR6基因缺失对小鼠的一般生长发育未见显著影响，但发现Ccr6-/-雌鼠的繁殖能力出现明显下降：其平均每窝产仔数为5～7 只，而Ccr6+/+雌鼠则为8～10 只。结果显示，在日常的繁殖管理中需对该品系雌鼠予以特别关注。同窝饲养条件下，Ccr6-/-小鼠体质量与Ccr6+/+小鼠相比差异无统计学意义（P=0.607 2，t=0.534 9）（图2A）。HE染色结果显示（图2B），两组小鼠的心肌纤维结构清晰，排列整齐；肝脏中肝细胞形态完整，无炎性浸润，肝窦结构清晰；肺泡间隔均匀，无渗出性病变；肾小管及肾小球结构正常，未见病理改变。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004.F002<italic>Ccr6<sup>+/+</sup></italic>小鼠和<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠的体质量对比及心脏、肝脏、肺和肾脏组织变化比较Comparison of body weight and changes in heart， liver， lung and kidney tissues between <italic>Ccr6<sup>+/+</sup></italic><sup> </sup>mice and <italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic> mice

A： Comparison of body weight between Ccr6+/+ mice and Ccr6-/- mice；B： HE staining images of heart，liver，lung and kidney tissues from Ccr6+/+ mice and Ccr6-/- mice ×40.

<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠外周血、脾脏和骨髓中CCR6表达情况

为验证Ccr6-/-小鼠的敲除情况，通过Western blot检测了Ccr6+/+和Ccr6-/-小鼠中多个组织的CCR6蛋白表达（图3），结果显示，与Ccr6+/+小鼠相比，Ccr6-/-小鼠的外周血、脾脏和骨髓中CCR6蛋白表达水平显著降低（P=0.003 9，t=6.000；P = 0.003 5，t=6.149；P=0.000 6，t=9.724）。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004.F003<italic>Ccr6<sup>+/+</sup></italic>小鼠和<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠血液、脾脏和骨髓中CCR6的表达情况The expression of<italic> </italic>CCR6 in the blood， spleen and bone marrow of the <italic>Ccr6<sup>+/+ </sup></italic>mice and <italic>Ccr6<sup>-/-</sup> </italic>mice

A：Blood；B： Spleen；C： Bone marrow；**P0.01，***P0.001 vs Ccr6+/+ group.

<italic>Ccr6<sup>-/-</sup></italic>小鼠中主要免疫细胞的比例

为了探究CCR6基因敲除是否会影响小鼠脾脏中主要免疫细胞的比例，采用流式细胞术检测了Ccr6+/+和Ccr6-/-小鼠脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞的比例。流式细胞术实验检测结果显示，与Ccr6+/+小鼠相比，Ccr6-/-小鼠脾脏中CD8+T细胞的比例增加（P=0.023 2，t=2.800），CD4+T细胞和巨噬细胞的比例保持不变（P=0.155 5，t=1.568；P=0.937 7，t=0.081）（图4）。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.03.004.F004<italic>CCR6</italic>基因的敲除对T细胞和巨噬细胞比例的影响The impact of<italic> CCR6</italic> gene knockout on the ratio of T cells and macrophages

A： The proportion of CD4+T cells in the spleen of mice remained unchanged， while the proportion of CD8+T cells increased；B： The proportion of macrophages in the mouse spleen remains unchanged；*P0.05 vs Ccr6+/+ group.

讨论

CRISPR/Cas9基因编辑系统由CRISPR序列和Cas9核酸内切酶两部分组成，其中CRISPR来源于原核生物基因组内的一段重复序列，而Cas9蛋白能够在sgRNA引导下对特定基因组位点进行精准切割。凭借其操作简便、靶向性强和编辑效率高等优势，该技术已成为构建基因修饰动物模型的首选工具［9–10］。在该研究中，针对CCR6基因设计特异性sgRNA，通过引导Cas9蛋白靶向切割基因组特定位点，诱导DNA双链断裂，成功构建了CCR6基因敲除小鼠模型。

CCR6的特异性配体为CCL20，在自身免疫性疾病中，免疫细胞和基质细胞高表达CCL20，通过募集CCR6阳性免疫细胞至炎症部位，促进炎症放大和组织损伤［7］。具体而言，在类风湿关节炎和银屑病中，炎症部位CCL20高表达，可招募CCR6+辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17），Th17细胞释放白细胞介素-17等炎症因子加剧炎症［7］；在多发性硬化症中，脑血管内皮细胞与蛛网膜细胞分泌CCL20，招募致病性T细胞穿越血脑屏障，导致中枢神经系统髓鞘结构受损，加速多发性硬化症进程［11］。研究［12］表明，CCL20/CCR6在肿瘤微环境调控中同样发挥关键作用：在前列腺癌中通过肿瘤相关巨噬细胞募集诱导T细胞耗竭并加速骨转移；在食管癌和膀胱癌中，CCL20介导的CCR6活化则分别促进肿瘤细胞增殖［13］和迁移侵袭［14–15］。这些研究结果充分表明，CCL20/CCR6的互作在多种疾病的发生发展中具有重要作用。

该研究通过CRISPR/Cas9技术构建CCR6基因敲除小鼠模型，并在SPF级环境中进行系统繁育。经基因型鉴定和Western blot验证，成功获得可稳定遗传的Ccr6-/-小鼠品系。该CCR6基因敲除小鼠模型为深入研究该受体在免疫调节及相关疾病机制中的作用提供了重要工具。通过比较Ccr6+/+与Ccr6-/-小鼠在疾病模型中的表型差异，能够直接揭示CCR6在炎症、自身免疫性疾病及肿瘤发展中的因果关系。此外，该模型是评估靶向CCR6治疗策略的重要标准：利用敲除鼠建立疾病模型，若小鼠疾病发展得到显著抑制，则强有力地证明阻断CCR6通路具有治疗潜力，从而为开发CCR6小分子拮抗剂或中和抗体提供理论依据。同时，通过长期监测CCR6基因敲除鼠的生理指标（如体质量变化与繁殖性能），也可为未来临床前安全性评价提供参考。

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