普通SD大鼠雌雄各半，6～7周龄，体质量（220±20）g，均购自安徽医科大学实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK（皖）2022-001；动物伦理号：LLSC20220998。大鼠饲养于（23±1）℃且相对湿度在55%～60% 的SPF级动物实验室，实行12 h光照和12 h黑暗循环，所有实验动物均可自由获得水和食物。

伊比利亚蝎毒素（iberiotoxin，IBTX）（货号：I275380）购自上海Aladdin生化科技有限公司；NaHS（货号：161527）购自美国Sigma公司；胰酶细胞消化液（货号：C0201）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012S）、凝胶配置试剂盒（货号：P0012A）和青霉素-链霉素溶液（货号：C0222）均购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM/F12 1∶1液体培养基（货号：BL305A）和Western一抗稀释液（货号：BL506 A）购自江苏Biosharp公司；K_Ca1.1通道激活剂NS 1619（货号：GC12547）购自上海宏叶生物科技有限公司；Ⅱ型胶原蛋白酶（货号：2275MG100）购自德国BioFroxx公司；L-半胱氨酸（L-Cysteine，L-Cys）（货号：L804954）购自上海麦克林生化科技有限公司；β-肌动蛋白（beta-actin，β-actin）（货号：AF7018）、大电导钙激活钾通道蛋白α1抗体（calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 antibody，KCNMA1）（货号：DF857）、超敏 ECL发光试剂盒（货号：180-501）、肌动蛋白 α 抗体（anti-alpha smooth muscle actin，Anti-alpha-SMA）（货号：AF 1032）和蛋白分子质量marker（货号：KF 8007）均购自美国Affinity 公司。

膜片钳系统1550数模转换器购自美国Molecular Devices公司；1-HL-U夹持器Holder和700B双电极放大器购自美国Molecular Devices公司；MP-285 /R电动微操纵器、P 97程控水平电极拉制仪购自美国Sutter公司。

全细胞膜片钳实验中将急性分离的VSMCs随机分为以下几个组别：① control组和IBTX组；② control组、NaHS组和NaHS+IBTX组；③ control组、TFCC 3.3 mg/L组、TFCC 10 mg/L组、TFCC 30 mg/L组、TFCC 90 mg/L组、TFCC 270 mg/L组^［9］、NS 1619 组和TFCC 270 mg/L+IBTX组；④ control组、L-Cys组、PPG组、L-Cys+PPG组和L-Cys+IBTX组；⑤ control组、TFCC 270 mg/L+PPG组、TFCC 270 mg/L+PPG+IBTX组。在Western blot实验中，给药满 12 h后观察control组、TFCC 30 mg/L组、TFCC 90 mg/L组、TFCC 270 mg/L组和IBTX组中BK_Ca通道蛋白含量的变化。

选择体质量在（220±20）g的SD大鼠，并用三溴乙醇将其麻醉。大鼠脑组织取出后，于冰上操作分离大脑中动脉，彻底去除血管外周附着组织。放入 0.5 mL的细胞消化液（其中称取胶原酶Ⅱ 0.01 g， 木瓜蛋白酶papain 0.046 g， 牛血清蛋白BSA 0.024 g和DTT 0.008 8 g溶于5 mL无钙PSS溶液）中，用剪刀剪碎，在 37 ℃的水浴中消化 30～40 min，然后吸出上清液，加入 1 mL BSA溶液于离心管中，在冰上静置10 min后吸去上清液。最后用1 mL 无钙PSS缓冲液洗2～3 次，吸去上清液后加入 0.5 mL的无钙PSS，最后在4 ℃冰箱放置 1～2 h。

取一皿细胞，静置40～50 min后，用细胞浴液［含NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl₂ 2 mmol/L，MgCl₂ 1.2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D（+）-Glucose 10 mmol/L，用NaOH调pH值 7.35～7.45］孵育5 min后开始实验。选取入液后电极阻抗为 2～6 MΩ 的电极，封接破膜后，待细胞形成全细胞模式，记录 VSMCs的BK_Ca通道电流数据。其中Ag/AgCl 银丝引导的电流信号经膜片钳放大器放大后，通过Clampfit 10.5 软件进行数据处理，其中整个实验过程温度控制在（23±2）℃。

取3只或者4只体质量在（220±20）g的普通SD大鼠，雌雄不限。用三溴乙醇将其麻醉，然后用生理盐水对大鼠进行灌流。过程中尽量保持无菌操作，75%乙醇喷洒表面以及器械。用高压过的手术器械剥离大鼠大脑，放入冰的含有PBS和双抗的溶液里，在超净台里剥离大鼠大脑中动脉血管组织，放入培养皿中。随后取一只离心管，把血管移至离心管中，用小剪刀将血管剪碎，然后平铺在T25 培养瓶底部，静置 4～6 h后，待血管组织贴壁牢固后再把T25培养瓶翻个面，并置于 37 ℃、含 5% CO₂的细胞培养箱中培养4～5 d，然后每隔48 h换1次液。

当培养瓶中长出血管平滑肌细胞后，经过一次传代到6孔板里，在细胞给药12 h后进行Western blot实验。裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）每孔打入200 µL，在冰上裂解30 min。离心机预冷4 ℃，12 000 r/min，离心20 min。将上清液吸出，转移至另一组EP管内。留10 µL用于测出蛋白浓度。然后用BCA蛋白含量试剂盒测出蛋白浓度。剩下的蛋白上清液中加入蛋白缓冲液（上清液∶缓冲液=1∶4）。蛋白质在 100 ℃、5 min煮变性，-20 ℃冻存。实验前首先需要配胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵育抗体和显影。其中Maxik alpha抗体（1∶2 000）和β-肌动蛋白抗体的比例为1∶3 000。

BK_Ca通道电流属于电压依赖性通道电流。本实验中BK_Ca通道电流测定的钳制电压设定为-60 mV，测试电压从-60 mV开始以 10 mV为一个单位跃迁到 +90 mV，时间间隔为 500 ms，设定的测定程序如图 1A所示。在玻璃微电极中灌入BK_Ca通道电极填充液（mmol/L：含K-glutamine 105，KCl 35 ，MgCl₂ 1，CaCl₂ 2.1，Na2ATP 5，EGTA 5.1，HEPES 10，用 5% KOH调节pH值 7.35～7.45）后，当电压达到+90 mV时，从大鼠大脑中动脉VSMCs中引出一呈电压依赖性的外向电流［电流密度：（36.95 ± 2.39） PA/PF］，并被BK_Ca通道特异性抑制剂IBTX（100 nmol/L）显著抑制［电流密度：（21.76 ± 2.15 ）PA/ PF，P0.01］，IBTX是一种高度的特异性抑制剂，它可通过与BK_Ca通道结合，明显抑制BK_Ca通道的开放，从而阻断其功能。如图1B所示，表明引出的电流符合BK_Ca通道电流为外向电流和电压依赖性的特征，并被特异性抑制剂IBTX阻断，因此，本研究在大鼠大脑中动脉VSMCs上记录到的外向电流为BK_Ca通道电流。

为了探究外源性H₂S对大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道的影响，实验结果如图1C所示，当电压达到+90 mV时，与control组［电流密度：（34.26 ± 1.04） PA/PF］比较，H₂S供体NaHS（100 μmol/L）可以明显增加大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流［电流密度：（60.70 ± 2.04） PA/PF ，P0.001］，但可被加入BK_Ca通道特异性抑制剂IBTX（100 nmol/L）明显抑制［电流密度：（42.67 ± 1.96） PA/PF，P0.01］。结果表明外源性H₂S可以激活BK_Ca通道，增加BK_Ca通道电流。

为了进一步探究内源性H₂S对BK_Ca通道电流的影响，该实验观察了H₂S合成酶CSE底物L-Cys和抑制剂PPG对大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道的作用。如图 2所示，当电压达到+90 mV时，与control组比较，L-Cys（100 nmol/L）可显著增加大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流［电流密度：（49.75 ± 2.17） PA/PF，P0.01］，并且可被BK_Ca通道阻断剂IBTX（100 nmol/L）明显减弱［电流密度：（37.04 ± 1.54） PA/PF，P0.01］；PPG（100 nmol/L）对BK_Ca通道电流虽然没有明显的影响［电流密度：（32.84 ± 1.28） PA/PF，P=0.77］，但可显著地减弱L-Cys增大BK_Ca通道电流作用［电流密度：（34.61 ± 2.72） PA/PF，P=0.000 1］。结果提示内源性H₂S可明显增加BK_Ca通道电流。

结果如图 3所示，当电压达到+90 mV时，与control组［电流密度：（34.23 ± 1.85）PA/PF］比较，TFCC 30［电流密度：（40.16 ± 2.23）PA/PF，P=0.002，P0.01］、90［电流密度：（44.80 ± 1.45）PA/PF，P0.01］ 和 270 mg/L［电流密度：（51.18 ± 0.67）PA/PF，P0.01］可明显地增强大鼠大脑中动脉VSMCs中引出的外向电流，且TFCC 30、90和270 mg/L组浓度增大之间差异有统计学意义（F=61.12，P0.01），其中以 270 mg/L TFCC的增强作用最为明显，并且被BK_Ca通道阻断剂IBTX（100 nmol/L）显著地减弱［电流密度：（41.69 ± 1.63）PA/PF，P0.01］；BK_Ca通道开放剂NS 1619（10 μmol/L）也有着类似地增强大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流的作用。结果表明TFCC可显著地增强大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流，它与NS 1619一样有着类似地增强大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流的作用。

当电压达到+90 mV时，结果显示，TFCC 270 mg/L［电流密度：（53.10 ± 1.27）PA/PF］对BK_Ca通道电流的增强可被H₂S合酶CSE特异性抑制剂PPG（100 nmol/L）明显减弱［电流密度：（44.69 ± 1.50）PA/PF，P0.05］，提示TFCC可通过内源性H₂S增强大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流。本研究还观察到PPG没有完全取消TFCC对BK_Ca通道电流的增强作用，与control组［电流密度：（32.63 ± 1.72）PA/PF］相比，剩余的电流仍有显著地增大［电流密度：（44.69 ± 1.50）PA/PF，P0.05］，可被加用IBTX进一步减弱［电流密度：（36.19 ± 0.98）PA/PF，P0.05］，提示TFCC可能对大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道电流还有直接的激活作用。见图4。

在培养的第 5～6天后，显微镜下观察到血管组织附近开始出现少量呈梭型或长条形细胞。15 d后发现细胞密集排列，形成类似于山峰的形态。20 d左右可以开始传代，传代后的细胞在显微镜下呈现三角形、长梭形或方形的形态。该实验采用免疫荧光技术对传代培养的细胞进行VSMCs表型鉴定。图5A的荧光显微观察显示，DAPI染色显示细胞核呈蓝色荧光，同时细胞质可见抗α-SMA抗体标记的绿色荧光信号，表明原代培养细胞质中存在血管平滑肌细胞标志物α-SMA，结果证实所培养细胞为大鼠大脑中动脉的血管平滑肌细胞。

上述实验探究了TFCC对大鼠大脑中动脉VSMCs的BK_Ca通道的电流影响，本研究还采用了Western blot法检测TFCC对BK_Ca通道中最重要的 α 亚基蛋白表达的影响。结果如图 5B、5C所示，各组中均有BK_Ca通道的 α 亚基蛋白的表达。但与control组相比，各剂量TFCC组及IBTX组中的BK_Ca通道蛋白表达含量差异无统计学意义。