YIKE安徽医科大学学报Acta Universitatis Medicinalis AnhuiActa Universitatis Medicinalis Anhui安徽医科大学学报1000-149234-1065/RAnhui Lianzhong Printing Limited CompanyEditorial Board of Acta Universitatis Medi-cinalis Anhui Meishan Road , Hefei 230032《安徽医科大学学报》编辑部安徽省合肥市安徽医科大学校内老图书馆三楼1000–1492（2026）04–0689–1010.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.01328 V310 白丽丽 -1R737.33A基础医学研究TNF-α调控的circWBSCR22通过miR-512-5p/FAM60A轴对宫颈癌细胞迁移、侵袭的影响The effect of TNF-α-regulated circWBSCR22 on the migration and invasion of cervical cancer cells through the miR-512-5p/FAM60A axis白丽丽BaiLili1234张瑾ZhangJin5樊亚童FanYatong1234张鹏宇ZhangPengyu1234天津医科大学肿瘤医院输血科，天津 300202Dept of Blood Transfusion， Tianjin Medical University Cancer Institute & Hospital， Tianjin 300202恶性肿瘤国家临床医学研究中心，天津 300202National Clinical Research Center for Cancer， Tianjin 300202天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300202Tianjin’s Clinical Research Center for Cancer， Tianjin 300202天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300202Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy， Tianjin 300202天津医科大学研究生院，天津 300202Graduate School of Tianjin Medical University， Tianjin 300202Zhang Pengyu， E-mail： pzhang@tmu.edu.cn

白丽丽，女，硕士研究生

张鹏宇，男，博士，主任技师，通信作者，E-mail： pzhang@ tmu.edu.cn

120320262304202661415689698689-698 20022026目的

探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）调控的环状RNA Williams Beuren综合征染色体区域22（circWBSCR22）对宫颈癌细胞恶性行为的影响及机制。

方法

TNF-α处理人宫颈癌HeLa细胞。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测circWBSCR22表达水平。核质RNA分离实验检测circWBSCR22在细胞中定位。分别通过Transwell实验、四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、克隆形成实验检测细胞迁移、细胞侵袭、细胞活性和细胞增殖能力。双荧光素酶报告基因实验验证微小RNA-512-5p （miR-512-5p）与circWBSCR22或序列相似性家族60A （FAM60A）的靶定关系。RT-qPCR检测miR-512-5p和FAM60A RNA水平。Western blot检测FAM60A蛋白水平。

结果

相比于Control组，TNF-α处理后HeLa细胞中circWBSCR22表达水平升高（P<0.05）。大约66%的circWBSCR22存在于细胞质中。相比于对照组，转染circWBSCR22后HeLa细胞的迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）能力增强，但细胞活性和细胞增殖能力无明显影响（P>0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示：与共转染circWBSCR22-WT和miR-NC组相比，共转染circWBSCR22-WT和miR-512-5p组相对荧光素活性降低（P<0.01）。与对照组相比，转染circWBSCR22后HeLa细胞中miR-512-5p表达水平降低（P<0.01）。与对照组相比，转染miR-512-5p后宫颈癌HeLa细胞迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）能力下降。双荧光素酶报告基因实验显示：与共转染FAM60A 3´-UTR-WT和miR-NC组相比，共转染FAM60A 3´-UTR-WT与miR-512-5p组荧光活性下降（P<0.01）。与对照组相比，转染miR-512-5p后HeLa细胞中FAM60A的RNA（P<0.05）和蛋白（P<0.01）表达水平降低。相比于对照组，转染FAM60A后宫颈癌HeLa细胞迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）能力增强。与对照组相比，转染circWBSCR22后，细胞中FAM60A RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.05）表达水平升高。挽救实验结果显示：相比于pcDNA+miR-NC组，pcDNA+miR-512-5p组FAM60A RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）表达水平降低且迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）能力降低；与pcDNA+miR-512-5p组相比，circWBSCR22+ miR-512-5p组FAM60A RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）表达水平升高且迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）能力增强。

结论

TNF-α通过circWBSCR22/miR-512-5p/FAM60A调控轴促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。

Objective

To explore the effect and mechanism of tumor necrosis factor alpha （TNF-α）-regulated circular RNA Williams Beuren syndrome chromosomal region 22 （circWBSCR22） on the malignant behaviors of cervical cancer cells.

Methods

Human cervical cancer HeLa cells were treated with TNF-α. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） was used to detect the expression level of circWBSCR22. Nuclear-cytoplasmic RNA separation experiments were conducted to determine the localization of circWBSCR22 in cells. Cell migration， invasion， viability， and proliferation were assessed through Transwell assay， tetrazolium salt （MTT） assay， and colony formation assay， respectively. Dual-luciferase reporter gene assays were performed to verify the targeting relationship between microRNA-512-5p （miR-512-5p） and circWBSCR22 or family with sequence similarity 60A （FAM60A）. RT-qPCR was used to detect the RNA levels of miR-512-5p and FAM60A. Western blot was used to detect the protein level of FAM60A.

Results

Compared with the Control group， the expression level of circWBSCR22 in HeLa cells treated with TNF-α increased （P<0.05）. About 66% of circWBSCR22 was found in the cytoplasm. Compared with the control group， the migration （P<0.01） and invasion （P<0.01） of HeLa cells transfected with circWBSCR22 were enhanced， but the cell activity and cell proliferation were not significantly affected （P>0.05）. The double luciferase reporter gene assay showed that the relative luciferase activity of the co transfected circWBSCR22-WT and miR-512-5p groups was lower than that of the co transfected circWBSCR22-WT and miR-NC groups （P<0.01）. Compared with the control group， the expression level of miR-512-5p in HeLa cells transfected with circWBSCR22 decreased （P<0.01）. Compared with the control group， the migration （P<0.01） and invasion （P<0.05） ability of HeLa cells transfected with miR-512-5p decreased. Double luciferase reporter gene assay showed that compared with the co transfected FAM60A 3´-UTR-WT and miR-NC groups， the fluorescence activity of the co transfected FAM60A 3´-UTR-WT and miR-512-5p groups decreased （P<0.01）.Compared with the control group， the expression levels of FAM60A mRNA （P<0.05） and protein （P<0.01） in HeLa cells transfected with miR-512-5p decreased. Compared with the control group， the migration （P<0.01） and invasion （P<0.01） of cervical cancer HeLa cells transfected with FAM60A were enhanced. Compared with the control group， the expression levels of FAM60A mRNA （P<0.01） and protein （P<0.05） in the cells transfected with circWBSCR22 increased. The results of rescue experiment showed that compared with the pcDNA+miR-NC group， the expression levels of FAM60A RNA （P<0.01） and protein （P<0.001） in the pcDNA+miR-512-5p group decreased， and the ability of migration （P<0.01） and invasion （P<0.05） decreased； Compared with pcDNA+miR-512-5p group， the expression levels of FAM60A RNA （P<0.01） and protein （P<0.001） in circWBSCR22+miR-512-5p group increased， and the ability of migration （P<0.01） and invasion （P<0.05） was enhanced.

Conclusion

TNF-α promotes the migration and invasion of cervical cancer cells through the circWBSCR22/miR-512-5p/FAM60A regulatory axis.

宫颈癌TNF-αcircWBSCR22miR-512-5pFAM60A迁移侵袭cervical cancerTNF-αcircWBSCR22miR-512-5pFAM60Amigrationinvasion国家自然科学基金项目82300944天津市医学重点学科建设资助项目TJYXZDXK-3-003A天津医科大学肿瘤医院科研项目Y1905国家自然科学基金项目（编号：82300944）；天津市医学重点学科建设资助项目（编号：TJYXZDXK-3-003A）；天津医科大学肿瘤医院科研项目（编号：Y1905）Fund programs National Natural Science Foundation of China82300944Tianjin Medical Key Discipline Construction FundTJYXZDXK-3-003AScientific Research Project of Tianjin Medical University Cancer Institute & HospitalY1905National Natural Science Foundation of China （No. 82300944）； Tianjin Medical Key Discipline Construction Fund （No. TJYXZDXK-3-003A）； Scientific Research Project of Tianjin Medical University Cancer Institute & Hospital （No. Y1905）version1.0.0.25071structure-time2026-05-28T11:37:16word-sourceFX

宫颈癌是女性癌症相关死亡的第四大原因，2022年全球统计数据表明全世界新增病例661 021例，死亡病例348 189例［1］。高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌发病的常见原因，感染过程中通常会激活白细胞介素和干扰素等炎性因子。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha， TNF-α）作为一种核心炎症介质，参与肿瘤免疫微环境的形成，影响肿瘤细胞存活、血管生成及免疫逃逸等恶性行为［2］。

环状RNA（circular RNAs， circRNAs）是一类共价闭合环状非编码RNA，既不含3′和5′末端，也没有polyA尾结构，比线性RNA更加耐受RNA酶消化，半衰期也更长久［3］。研究［4］表明在宫颈癌细胞中异常表达的circRNAs可以调控肿瘤进展。为探究炎症介质是否调节circRNAs表达进而影响宫颈癌细胞恶性行为，用TNF-α处理HeLa细胞后通过高通量测序发现circWBSCR22表达水平升高，并深入研究发现其通过吸附微小RNA（microRNAs， miRNAs），进而减轻miRNAs对靶基因的抑制作用，从而促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。

材料与方法主要材料与仪器

人宫颈癌细胞系HeLa细胞购自上海ATCC细胞库。circWBSCR22和FAM60A过表达/敲降载体及其阴性对照载体pcDNA3.1（pcDNA）/pshR-NC，miR-512-5p mimic （miR-512-5p） 及阴性对照miR-NC、miR-512-5p inhibitor （ASO-miR-512-5p）及阴性对照ASO-NC均由上海通用生物有限公司合成。RPMI-1640培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国GIBCO公司；TNF-α、四甲基偶氮唑盐（tetrazolium salt， MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、结晶紫染液、PVDF膜、TBST洗膜液购自上海碧云天生物科技有限公司；lipofectamine 3000、TRIzol、TEMED购自美国Invitrogen公司；RNA分离试剂盒购自美国Active motif公司； SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司； Millicell® cell culture insert购自德国Billerica MA公司； Matrigel胶购自美国BD Biosciences公司； GAPDH抗体、FAM60A抗体、HRP标记抗兔二抗购自天津赛尔生物公司；Pierce Renilla Firefy萤光素酶双重测定试剂盒购自美国Termo Fisher Scientific公司。细胞培养箱购自美国Thermo Forma公司；倒置光学显微镜购自日本NiKon公司。

方法细胞培养和处理

在含有8％胎牛血清、100 µg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培养基中培养，孵育于37 ℃含5％CO2的培养箱中。细胞培养40 h后加入60 ng/mL TNF-α，作用8 h收集细胞，无TNF-α处理做为对照组。

细胞转染及分组

将人宫颈癌HeLa细胞接种至6孔板中，使用lipofectamine 3000试剂将寡核苷酸转染到HeLa细胞中，并分成Control组（无TNF-α处理）、TNF-α组（TNF-α处理）、pcDNA组（转染pcDNA）、pshR-NC组（转染pshR-NC）、circWBSCR22组（转染circWBSCR22）、pshR-circWBSCR22组（转染pshR-circWBSCR22）、miR-NC组（转染miR-NC）、miR-512-5p组（转染miR-512-5p）、ASO-NC组（转染ASO-NC）、ASO-miR-512-5p组（转染ASO-miR-512-5p）、FAM60A组（转染FAM60A）、pshR-FAM60A组（转染pshR-FAM60A）、pcDNA+miR-NC组（转染pcDNA+miR-NC）、pcDNA+miR-512-5p组（转染pcDNA+miR-512-5p）、circWBSCR22+miR-512-5p组（转染circWBSCR22+miR-512-5p）。

逆转录荧光定量PCR（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）检测circWBSCR22、miR-512-5p和FAM60A的RNA表达水平

将各组人宫颈癌HeLa细胞接种至6孔板中，待细胞生长密度达到80%~90%时使用TRIzol试剂提取总RNA。按照逆转录试剂盒步骤将RNA逆转录为cDNA。通过SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行RT-qPCR分析。反应条件：预变性94 ℃，10 min；变性94 ℃，15 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40个循环。反应体系：RT产物（cDNA）1.0 μL，5 pmol/μL上/下游引物各1.0 μL，2× UltraSYBR Mixture 7.5 μL，加双蒸水补至15 μL。利用2-ΔΔCT公式计算各基因 mRNA相对表达水平，以β激动蛋白（β-actin）作为内参照。引物序列参照表1。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.T001

引物序列

Primer sequences
GenePrimer sequences
circWBSCR22F： 5′-CTGCCATGCTGGGTGAGGCTGTG-3′
R： 5′-GCAGATAAAGAAGCTCCAATGCTC-3′
miR-512-5pF： 5′-CACUCAGCCUUGAGGGCACUUUC-3′
R： 5′-AAGUGCCCUCAAGGCUGAGUGUU-3′
FAM60AF： 5'-CTCCAGTTCTCGATTCACTGAC-3'
R： 5'-CGAGTCTCATGCAATCCAAAACA-3'
β-actinF：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′
R： 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′
U6F： 5′-TCACTCCACGGTCGTACTT-3′
R： 5′-GCAGATCCTCACCGATTACGG-3′
核质RNA分离

根据说明书要求使用RNA亚细胞分离试剂盒裂解HeLa细胞以分离细胞核和细胞质RNA。

Western blot检测FAM60A的蛋白表达水平

转染48 h后，1× PBS洗涤细胞2次，120 μL RIPA缓冲液在4 ℃裂解30 min。通过SDS-PAGE将全细胞裂解物分离并转移到PVDF膜上。用5%脱脂乳封闭2 h后，将PVDF膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。一抗使用如下：FAM60A（1∶200），GAPDH（1∶3 000）。用TBST溶液洗涤后，将PVDF膜与二抗（绵羊抗兔IgG-HRP，1∶5 000）孵育2 h，并通过增强化学发光（ECL）检测。通过ImageJ对谱带强度进行量化。

双荧光素酶报告基因实验验证miR-512-5p与circWBSCR22或FAM60A的靶定关系

通过Circinteractome数据库预测miR-512-5p与circWBSCR22的潜在结合位点，通过Targetscan数据库预测miR-512-5p与FAM60A的潜在结合位点。扩增含有miR-512-5p结合位点的circWBSCR22或FAM60A 3´-UTR 的野生型和突变型序列，分别插入到萤光素酶报告载体pGL3中，构建野生型质粒（circWBSCR22-WT和FAM60A 3´-UTR-WT）和突变型质粒（circWBSCR22-MUT和FAM60A 3´-UTR-MUT）。随后将构建的荧光素酶报告基因载体和miR-NC、miR-512-5p、ASO-NC、ASO-miR-512-5p共转染到HeLa细胞。孵育24 h后，根据Pierce Renilla Firefy萤光素酶双重测定试剂盒操作步骤测量萤光素酶活性。

MTT实验检测细胞活性

转染24 h后，将细胞接种到96孔板（4 000个/孔）中，每个实验组包括5个重复孔。在指定的时间点（24、48、72 h），加入MTT（10 µL/孔），并在37 ℃下再孵育4 h。丢弃培养基后，加入DMSO（100 µL/孔）以溶解沉淀的甲酰胺。使用酶标仪检测570 nm处的吸光度（absorbance， A）（A570）。

克隆形成实验检测细胞增殖能力

在转染后24 h，将HeLa（400个/孔）细胞接种到12孔板中。每4 d更换1次新鲜培养基。2周后，用1× PBS洗涤细胞2次，用结晶紫染色，然后计算细胞集落形成率。

Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

通过Transwell小室（8.0 μmol/L孔径）检测细胞迁移和侵袭能力，其中加入Matrigel用于侵袭实验，不加入Matrigel用于迁移实验。将冷冻的基质胶与无血清基础培养基（1∶6）混合，接种到Transwell室（45 μL/室）中，并在37 ℃下孵育2 h以固化。将HeLa细胞（6×104用于迁移，8×104用于侵袭）重悬于200 μL无血清RPMI-1640培养基中，并接种到上室中。用600 μL RPMI-1640或含有10% FBS的DMEM培养基填充下腔。培养48 h或72 h后，用1× PBS冲洗下腔，用棉交换去除下腔上表面未迁移或未侵入的细胞，并用750 μL固定液（体积比为1∶3的冰醋酸和甲醇）固定20 min。在用2%结晶紫染色5 min后，在Nikon TE2000显微镜下对5个随机选择的视场进行成像。每组实验重复3次。

统计学处理

所有实验数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行，两组间比较采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。所有定量数据均显示为平均值±标准差（x¯±s）。P<0.05为差异有统计学意义。每组实验的结果重复至少3次。

结果TNF-<bold>α</bold>对circWBSCR22表达水平的影响

TNF-α处理宫颈癌HeLa细胞后进行RT-qPCR实验，与Control相比，TNF-α组circWBSCR22表达水平升高（P<0.05），见图1A。核质RNA分离联合RT-qPCR实验结果显示约有66%的circWBSCR22位于细胞质，提示circWBSCR22主要定位于细胞质中，见图1B。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F001TNF-<bold>α</bold>处理后HeLa细胞中circWBSCR22表达水平及细胞定位Expression level and cellular localization ofcircWBSCR22 in HeLa cells after TNF-<bold>α</bold> treatment

A： RT-qPCR was used to detect the expression level of circWBSCR22； B： Nuclear-cytoplasmic RNA separation experiment combined with RT-qPCR was used to detect the expression levels of circWBSCR22 in the nucleus and cytoplasm； a： Control group； b： TNF-α group； c： circWBSCR22 group； d： U6 group； e： β-Actin group； *P<0.05 vs Control group.

CircWBSCR22对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响

RT-qPCR实验结果显示：相较于各自对照组，过表达组circWBSCR22表达水平升高（P<0.001），敲降组circWBSCR22表达水平降低（P<0.01），表明过表达及敲降质粒构建成功，见图2A。Transwell实验结果显示：circWBSCR22组宫颈癌HeLa细胞的迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）数目均高于pcDNA组；pshR-circWBSCR22组宫颈癌HeLa细胞的迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）数目较pshR-NC组减少，见图2B、2C。MTT实验和克隆形成实验结果显示： 与各自对照组相比，circWBSCR22组和pshR-circWBSCR22组宫颈癌HeLa细胞的活力和细胞增殖能力变化差异无统计学意义，见图2D、2E。结果提示circWBSCR22促进宫颈癌HeLa细胞的迁移和侵袭能力，对细胞活性和细胞增殖能力无影响。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F002CircWBSCR22对宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭、细胞活力和细胞增殖能力的影响The effects of circWBSCR22 on the migration， invasion， viability， and proliferation of cervical cancer HeLa cells

A： RT-qPCR was used to detect the overexpression of circWBSCR22 and the effectiveness of knockdown plasmids； B： Transwell migration assay was used to detect the relative number of migrated HeLa cells and microscopic images （crystal violet staining ×100） were shown； C： Transwell invasion assay was used to detect the relative number of invaded HeLa cells and microscopic images were shown （crystal violet staining ×100）； D： MTT assay was used to detect the effects of circWBSCR22 on cell viability； E： Cell colony formation assay was used to detect the effects of circWBSCR22 on cell proliferation （crystal violet staining）； a： pcDNA group； b： circWBSCR22 group； c： pshR-NC group； d： pshR-circWBSCR22 group； **P<0.01， ***P<0.001 vs pcDNA group； ##P<0.01 vs pshR-NC group.

CircWBSCR22吸附并调控miR-512-5p表达水平

CircInteractome数据库预测结果显示circWBSCR22和miR-512-5p具有结合位点，见图3A。双荧光素酶报告基因实验结果显示：在circWBSCR22-WT转染的HeLa细胞中，与miR-NC组相比，miR-512-5p组相对荧光素活性降低（P<0.01）；与ASO-NC组比较，ASO-miR-512-5p组荧光活性升高（P<0.05）。而在circWBSCR22-MUT转染的HeLa细胞中各组之间荧光活性差异无统计学意义，见图3A。另外，在宫颈癌HeLa细胞中，与pcDNA组相比，circWBSCR22组miR-512-5p表达水平降低（P<0.01）；与pshR-NC组相比，pshR-circWBSCR22组miR-512-5p表达水平升高（P<0.05），见图3B。结果提示circWBSCR22吸附miR-512-5p并降低其表达水平。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F003CircWBSCR22吸附并调控miR-512-5p表达水平CircWBSCR22 adsorbed and regulated the expression level of miR-512-5p

A： Dual-luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between circWBSCR22 and miR-512-5p； B： RT-qPCR was used to detect the effect of circWBSCR22 on the expression level of miR-512-5p； a： miR-NC group； b： miR-512-5p group； c： ASO-NC group； d： ASO-miR-512-5p group； e： pcDNA group； f： circWBSCR22 group； g： pshR-NC group； h： pshR-circWBSCR22 group； **P<0.01 vs miR-NC group； #P<0.05 vs ASO-NC group； △△P<0.01 vs pcDNA group； □P<0.05 vs pshR-NC group.

miR-512-5p对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响

细胞功能学实验结果显示：相比于miR-NC组，miR-512-5p组宫颈癌HeLa细胞迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）的细胞数减少；相比于ASO-NC组，ASO-miR-512-5p组宫颈癌HeLa细胞迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）的细胞数增多，见图4A、4B。结果提示miR-512-5p抑制宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F004miR-512-5p对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响The effects of miR-512-5p on the migration and invasion ability of cervical cancer HeLa cells

A： Transwell migration assay was to detect the relative number of migrated HeLa cells and microscopic images （crystal violet staining ×100） were shown； B： Transwell invasion assay was used to detect the relative number of invaded HeLa cells and microscopic images （crystal violet staining ×100） were shown； a： miR-NC group； b： miR-512-5p group； c： ASO-NC group； d： ASO-miR-512-5p group； *P<0.05， **P<0.01 vs miR-NC group； ##P<0.01 vs ASO-NC group.

miR-512-5p靶向并调控FAM60A表达水平

Targetscan数据库预测结果显示miR-512-5p与FAM60A存在结合位点，见图5A。双荧光素酶报告基因实验结果显示：在FAM60A 3´-UTR-WT转染的HeLa细胞中，与miR-NC组相比，miR-512-5p组荧光活性下降（P<0.01）；与ASO-NC组相比，ASO-miR-512-5p组荧光活性升高（P<0.01）。而在FAM60A 3´-UTR-MUT转染的HeLa细胞中，各组相对荧光素活性差异无统计学意义，见图5A。另外，在宫颈癌HeLa细胞中，过表达miR-512-5p后FAM60A的RNA（P<0.05）和蛋白（P<0.01）表达水平下降，而封闭miR-512-5p后则升高了FAM60A的RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.01）表达水平，见图5B、5C。结果提示miR-512-5p靶定FAM60A并抑制其表达。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F005miR-512-5p靶向并调控FAM60A表达水平miR-512-5p targeted and regulated the expression of FAM60A

A： Dual-luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-512-5p and FAM60A； B： RT-qPCR was used to detect the effects of miR-512-5p on FAM60A mRNA expression level； C： Western blot experiment was used to detect the effects of miR-512-5p on FAM60A protein expression level； a： miR-NC group； b： miR-512-5p group； c： ASO-NC group； d： ASO-miR-512-5p group； *P<0.05， **P<0.01 vs miR-NC group； ##P<0.01 vs ASO-NC group.

FAM60A对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示：与pcDNA组相比，FAM60A组迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）的宫颈癌HeLa细胞数目增多；与pshR-NC组相比，pshR-FAM60A组迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.01）的宫颈癌HeLa细胞数目减少，见图6。结果提示FAM60A促进宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F006FAM60A对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响The effects of FAM60A on the migration and invasion ability of cervical cancer HeLa cells

A： Relative migration cell count and microscopic image （crystal violet staining ×100） of HeLa cells detected by Transwell migration assay； B： Relative invasion cell count and microscopic image （crystal violet staining ×100） of HeLa cells detected by Transwell invasion assay； a： pcDNA group； b： FAM60A group； c： pshR-NC group； d： pshR-FAM60A group； **P<0.01 vs pcDNA group； ##P<0.01 vs pshR-NC group.

CircWBSCR22通过miR-512-5p/FAM60A轴对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭能力的影响

RT-qPCR实验和Western blot实验结果显示：相比于pcDNA组，过表达circWBSCR22后FAM60A的RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.05）表达水平升高；相比于pshR-NC组，敲降circWBSCR22后FAM60A的RNA（P<0.05）和蛋白（P<0.01）表达水平降低，见图7A、7B。分子生物学挽救实验显示：相比于pcDNA+miR-NC组，pcDNA+miR-512-5p组FAM60A的RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）表达水平降低；相比于pcDNA+miR-512-5p组，circWBSCR22+miR-512-5p组FAM60A的RNA（P<0.01）和蛋白（P<0.001）表达水平升高，见图7C、7D。同样，细胞功能学挽救实验显示：相比于pcDNA+miR-NC组，pcDNA+miR-512-5p组迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）的细胞数目减少；相比于pcDNA+miR-512-5p组，circWBSCR22+miR-512-5p组迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）的细胞数目增多，见图7E、7F。

10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.04.013.F007CircWBSCR22通过miR-512-5p/FAM60A轴对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭能力的影响The effects of circWBSCR22 on the migration and invasion ability of cervical cancer HeLa cells <italic>via</italic> mir-512-5p/FAM60A axis

A： RT-qPCR was used to detect the effect of circWBSCR22 on the expression level of FAM60A RNA； B： Western blot was used to detect the effect of circWBSCR22 on the expression level of FAM60A protein； C-D： RNA and protein levels of FAM60A in the pcDNA+miR-NC group， pcDNA+miR-512-5p group， and circWBSCR22+miR-512-5p group； E-F： Relative migration and invasion cell number of HeLa cells in the pcDNA+miR-NC group， pcDNA+miR-512-5p group， and circWBSCR22+miR-512-5p group， along with microscopic images （crystal violet staining ×100）； a： pcDNA group； b： circWBSCR22 group； c： pshR-NC group； d： pshR-circWBSCR22 group； e： pcDNA+miR-NC group； f： pcDNA+miR-512-5p group； g： circWBSCR22+miR-512-5p group； *P<0.05， **P<0.01 vs pcDNA group； #P<0.05， ##P<0.01 vs pshR-NC group； △P<0.05， △△P<0.01， △△△P<0.001 vs pcDNA+miR-NC group； □P<0.05， □□P<0.01， □□□P<0.001 vs pcDNA+miR-512-5p group.

讨论

已有研究［5–6］表明炎症因子在诱导癌症发生过程中会导致大量非编码RNA （noncoding RNAs， ncRNAs） 的异常表达，并对细胞内致癌或抑癌基因的表达起到调节作用。作为炎症微环境的关键介质，TNF-α在炎症相关性癌症中发挥重要功能。为探究TNF-α在肿瘤细胞中的作用是否有circRNAs参与，首先用60 ng/mL TNF-α处理HeLa细胞，通过高通量测序检测并分析异常表达的circRNAs，结果显示circWBSCR22水平升高较为明显。随后通过RT-qPCR验证TNF-α确实可以促进circWBSCR22表达。关于TNF-α对肿瘤进展的影响方面，有研究［7］表明60 ng/mL TNF-α上调CircDMD的表达促进肿瘤增殖、转移和自噬。另有研究［8］表明100 ng/mL高剂量的TNF-α增加miR-765的表达并可以在体外显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的迁移。这表明TNF-α等炎性因子在肿瘤中的作用具有剂量和空间异质性。TNF-α使用剂量/作用时间及作用部位不同，使其调控不同的特定基因从而发挥不同生物学作用。

CircRNAs与癌症的发生发展密切相关，已有大量研究表明多种circRNAs发挥抑癌或促癌作用［9］。同样，在宫颈癌中异常表达的circRNAs也可以影响肿瘤进展，如宫颈癌细胞中显著上调的circRNA PLEKHM3可以调控宫颈癌细胞的上皮间质转化［10］。为探究circWBSCR22是否影响宫颈癌进展，进行了一系列细胞功能学实验。实验结果表明过表达circWBSCR22促进宫颈癌HeLa细胞的迁移和侵袭，但对细胞活性和细胞增殖能力无明显影响。因此后续仅进行迁移和侵袭实验。CircRNAs可作为miRNAs “海绵”调控下游靶基因的表达影响癌症的发生发展［3］。核质RNA分离实验表明circWBSCR22主要存在于细胞质中，这一特性增加了其吸附miRNAs的可能性，因此circWBSCR22可能通过调控miRNAs表达发挥生物学功能。为进一步探究circWBSCR22是否存在类似作用机制，首先通过CircInteractome数据库预测发现circWBSCR22与miR-512-5p存在相互作用位点，而后通过双荧光素酶报告基因实验证实了二者之间的靶定关系。过表达circWBSCR22明显抑制了宫颈癌细胞中miR-512-5p水平，细胞功能挽救实验结果显示，circWBSCR22挽救了miR-512-5p的抑癌作用。这表明miR-512-5p参与了circWBSCR22对宫颈癌细胞恶性进展的负调控作用。此外，circRNAs还可以与DNA或蛋白质相互作用［3］。研究［11］表明，circWBSCR22直接与UPF1结合，阻碍了CHD4蛋白泛素化降解从而促进结直肠癌转移。这说明circWBSCR22可以通过与不同分子相互作用影响肿瘤进展。

miRNAs主要通过靶向和调控mRNAs参与细胞增殖、分化和细胞周期的调控等肿瘤生物学行为［12］。本研究表明miR-512-5p抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。为探究miR-512-5p通过调控哪种靶mRNA发挥作用，通过利用Targetscan数据库预测发现miR-512-5p与FAM60A存在潜在结合位点，双荧光素酶报告基因实验证实了二者之间的靶定关系，且后期实验证实miR-512-5p靶向并抑制FAM60A表达。FAM60A是Sin3脱乙酰酶复合物的一个新亚基，在细胞周期调控、细胞形态改变、细胞增殖、分化迁移等方面发挥重要作用［13］。已有研究［14］表明FAM60A影响肿瘤细胞迁移和侵袭，因而选择FAM60A作为侯选目标靶基因进行研究。实验结果证实FAM60A促进宫颈癌HeLa细胞的迁移和侵袭。为确定circWBSCR22对宫颈癌HeLa细胞迁移侵袭能力影响是通过miR-512-5p/FAM60A轴发挥作用的，进行了挽救实验。实验结果进一步证实circWBSCR22通过miR-512-5p促进FAM60A表达。由此可见，TNF-α调控的circWBSCR22通过miR-512-5p/FAM60A轴促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。

本研究揭示TNF-α可以通过circWBSCR22/miR-512-5p/FAM60A轴促进宫颈癌细胞迁移和侵袭，为炎症驱动的肿瘤进展提供了分子途径。靶向circWBSCR22可能成为宫颈癌精准治疗的候选分子。但该研究主要基于细胞内实验，尚需通过动物模型进一步验证circWBSCR22对肿瘤生长和转移的影响。且circWBSCR22可能通过与其他miRNAs或蛋白质发生相互作用，接下来将通过多组学联合分析其互作网络，更深入全面的阐明其作用机制。

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