从癌症基因组图谱 （the cancer genome atlas， TCGA）下载153例GBM样本和5例对照样本。从GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索了2个GBM相关数据集，分别是GSE116520（GBM17例和对照8例）和GSE4290（GBM77例和对照23例）。用R语言中的“limma”包识别DEGs，选择对数倍数变化（fold change， FC）>1.30和 P<0.05为上调DEGs的筛选标准，FC<0.77和P<0.05为下调DEGs的筛选标准^［6］。微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）分别对3个数据集中的上调表达基因和下调表达基因进行交集分析，确定交集基因。

人GBM细胞株U87、T98G、HS683和U251（货号：CL-0238、CL-0583、CL-0362和 CL-0237）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。另外2个GBM细胞株SHG44（货号：YS2373C）和正常人星形胶质细胞NHA（货号：YS2144C）购自上海雅吉生物科技有限公司。DMEM培养基（货号：C2707）、胎牛血清（FBS，货号：C0251）、TRIzol试剂（货号：R0016）、RIPA裂解液（货号：P0039）、PVDF膜（货号：FFP22）、Matrigel（货号：C0376）、结晶紫染色液（货号：Y268091-100g）、BCA蛋白检测试剂盒（货号：P0012）、SDS-PAGE胶（货号：P0057A）、聚凝胺（Polybrene，货号：C0351）、嘌呤霉素（Puromycin，货号：ST551-10mg）、酶标仪（货号：E0228）、4%多聚甲醛（货号：P0099）、CCK-8试剂盒（货号：C0038）、ECL化学发光试剂盒（货号：P0018AS）、抗p-PI3K（货号：AA329，1∶1 000）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（货号：A0208，1∶1 000）均购自上海碧云天生物技术公司；PrimeScript RT试剂盒（货号：RR037A）和SYBR Green预混液（货号：RR820A）购自日本Takara Bio公司；Transwell小室（货号：3422）购自美国Corning公司；抗FAH（货号：14928-1-AP，1∶2 000）、抗PI3K（货号：20584-1-AP，1∶1 000）、抗p-AKT（货号：80455-1-RR，1∶4 000）、抗AKT（货号：10176-2-AP，1∶2 000）、抗p-4EBP1（货号：81812-4-RR，1∶1 000）、抗p-S6（货号：29223-1-AP，1∶4 000）、抗4EBP1（货号：13988-1-AP，1∶1 000）、抗S6（货号：80208-1-RR，1∶5 000）和抗GAPDH（货号：10494-1-AP，1∶5 000）购自武汉三鹰生物技术公司；携带 FAH shRNA 的慢病毒载体（shFAH）及阴性对照（shNC）购自上海GenePharma公司；QuantStudio^TM 6 Flex实时荧光定量PCR系统（货号：4485692）购自美国Applied Biosystems公司。

使用R语言的“WGCNA”包，对从TCGA-GBM、GSE4290和GSE116520数据集中鉴定出的交集基因进行WGCNA。软阈值设置为6，以确保无标度拓扑结构。基于拓扑重叠矩阵 （topological overlap matrix， TOM），采用平均链接层次聚类法对基因进行聚类，并使用动态树切割算法识别模块。然后，使用ESTIMATE算法（R包“estimate”）计算模块特征基因 （module eigengene， ME） 与肿瘤纯度（tumor purity）、基质评分（stromal score）、免疫评分（immune score）和ESTIMATE评分（ESTIMATE score）。与TME相关性最强的模块被认为是进一步功能富集分析的关键模块。

使用Enrichr数据库（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）对WGCNA识别的绿松石模块中的基因进行基因本体论（gene ontology， GO）富集分析，包括生物过程（biological process， BP）、细胞成分（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）。同时，还进行了京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路分析，以识别显著富集的通路。使用R语言包“ggplot2”生成条形图和气泡图对结果进行可视化。

对TCGA-GBM数据集中的61个关键基因进行单变量Cox回归分析，利用“forestplot”包绘制森林图，计算每个变量的P值、风险比（hazard ratios， HR）和95%置信区间（confidence interval， CI），以评估其与总生存的关联。进一步使用GEPIA 2数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）验证了关键预后相关基因的表达谱。使用R语言中的“glmnet”包进行最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operato， LASSO）回归分析，其中惩罚参数（λ）通过基于最小偏似然偏差的10倍交叉验证确定。根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。采用 Kaplan-Meier 生存分析比较两个风险组的总生存率（overall survival， OS），计算HR及 95%CI，对数秩检验P值评估统计学意义。使用R语言中的“timeROC”包进行1、3年的受试者工作特征 （receiver operating characteristic， ROC） 曲线分析，并计算曲线下面积 （under the curve， AUC） 。

从肿瘤免疫单细胞中心（tumor immunity single cell center， TISCH）数据库（http：//tisch.comp-genomics.org/）获取了3个scRNA-seq数据集（GSE131928、GSE139448 和GSE162631）。经过质量控制和标准化后，使用R语言中的“Seurat” 包进行细胞聚类和注释。使用 UMAP 特征图和 “Seurat/ggplot2” 生成的小提琴图可视化CTSD、FAH和THBD 在不同细胞类型中的表达模式。

使用TIMER数据库（http：//timer.cistrome.org/）进一步分析GBM中预后相关基因表达与免疫细胞浸润之间的相关性。检测CTSD、FAH和THBD的表达水平与肿瘤纯度（tumor purity）、B细胞、CD8⁺ T细胞（CD8⁺ T cell）、CD4⁺ T细胞（CD4⁺ T cell）、巨噬细胞（macrophage）、中性粒细胞（neutrophil）和树突状细胞（dendritic cell）的相关性。

使用来自TCGA-GBM队列的RNA测序数据，分析了GBM和正常脑组织中FAH的表达。对每百万转录本（transcripts per million， TPM）值进行Log₂（TPM+1）转换以进行比较。根据样本类型（正常vs原发性肿瘤）、患者年龄（21~40、41~60、61~80和>80岁）、性别（男性vs女性）和TP53突变状态（突变vs非突变）进行亚组分析。为了进一步验证FAH蛋白的表达，基于人类蛋白质图谱（HPA，https：//www.proteinatlas.org/）中提供的抗FAH抗体对正常脑组织和GBM组织进行IHC分析。根据染色强度和阳性细胞比例比较正常组织和肿瘤组织中的蛋白质表达水平。

使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估FAH表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的相关性。通路基因集来自分子特征数据库（MSigDB）。从TCGA-GBM转录组数据中提取FAH表达水平，并将其标准化为TPM。进行皮尔逊相关性分析以评估FAH表达与通路富集评分之间的关联。计算相关系数r和P值，并使用R语言的“GSVA”和“ggplot2”生成拟合回归线的散点图。

人GBM细胞株（U87、T98G、U251、SHG44、HS683）和正常人星形胶质细胞（NHA）放置在添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中，在37 ℃、5% CO₂的湿润环境中培养。

将携带 FAH shRNA 的慢病毒载体（shFAH）及阴性对照（shNC）感染 U87 和 T98G 细胞。在polybrene（8 μg/mL）存在下增强感染效率，使用嘌呤霉素（2 μg/mL）筛选7 d，建立稳定的 FAH沉默细胞系。

使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒进行逆转录。使用SYBR Green预混液在QuantStudio^TM 6 Flex实时PCR系统上进行qPCR。循环条件：95 ℃、30 s，随后40个循环（95 ℃、5 s，60 ℃、30 s），并进行熔解曲线分析以确认引物特异性。以GAPDH作为内参，使用2^-ΔΔCT方法计算相对表达量。FAH 正向引物5′-CTCTCCGCACGCCACCTTAG-3′，反向引物5′-GCCAATGGCCACACCTATCC-3′。GAPDH 正向引物5′-CTAGCTGGCCCGATTTCTCC-3′，反向引物5′-ATGGAATTTGCCATGGGTGG-3′。

使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取等量的蛋白，经10% SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，将膜与以下一抗（抗FAH、抗p-PI3K、抗PI3K、抗p-AKT、抗AKT、抗p-4EBP1、抗4EBP1、抗p-S6、抗S6、抗GAPDH）在4 ℃孵育过夜。接着使用二抗（HRP偶联抗兔抗体）在室温下孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒对蛋白条带进行可视化，并使用ImageJ软件进行定量分析。

使用CCK-8试剂盒测量细胞增殖。将U87和T98G细胞（2 × 10³细胞/孔）接种于96孔板中。在指定时间点（第1~5天），向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育2 h。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度（absorbance，A）。

使用Transwell小室（孔径8 μm）评估细胞侵袭和迁移。侵袭实验中，上室预包被Matrigel，迁移实验中则无需Matrigel。将5 × 10⁴细胞接种于无血清培养基中，并将含10% FBS的培养基加入下室作为趋化剂。24 h后，迁移或侵袭至下室表面的细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，并在显微镜下计数。

雌性BALB/c裸鼠（4~6周龄，18~20 g）购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。将稳定转染shNC或shFAH的U87细胞（5×10⁶）皮下注射至小鼠侧腹（每组6只）。每3 d用卡尺测量一次肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为（长×宽²）/2。28 d后，采用二氧化碳吸入法处死小鼠，然后进行颈椎脱位，切除肿瘤，称重并拍照。所有动物实验均已获得安徽医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：LLSC20230730）。

所有统计学分析均使用GraphPad Prism 8.0和R软件（版本4.0.3）进行。数据以至少3次独立实验的平均值±标准差（x¯±s）表示。两组间差异采用Student’s t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。生存曲线采用 Kaplan-Meier 方法绘制，并采用对数秩检验进行比较。HR和95%CI采用单因素和多因素Cox回归分析计算。P<0.05为差异有统计学意义。

对3个GBM相关数据集（TCGA-GBM、GSE4290和GSE116520）进行了差异表达分析。火山图显示，每个数据集中均存在大量显著上调和下调的基因（图1A-1C）。其中，TCGA-GBM数据集中有5 434个基因上调，3 824个基因下调（图1A）；GSE4290数据集中有2 241个基因上调，1 200个基因下调（图1B）；GSE116520 数据集中有1 633个基因上调，1 189个基因下调（图1C）。维恩图分析显示，在3个数据集中鉴定出146个重叠下调基因和66个重叠上调基因（图 1D、1E）。进一步基于WGCNA研究GBM相关基因的共表达模式。设定软阈值幂为6，以保证网络符合无尺度拓扑结构（图2A）。层次聚类分析识别出2个基因模块，灰色模块为未分配基因，不纳入后续G通路分析表明这些基因还在趋化因子信号转导、造血细胞谱系通路等通路中显著富集（图3D）。

采用单因素Cox回归分析对绿松石模块中的61个基因进行单因素Cox分析，结果显示，5个基因（HK3、THBD、CTSD、FAH和FCN3）的预后结果较为显著（HR > 1）（图4A）。GEPIA数据库分析显示，CTSD、FAH、HK3和THBD在GBMy样本中上调（P<0.05），而FCN3的表达差异无统计学意义（图4B-4F）。进一步对这4个预后基因进行LASSO Cox回归分析，根据λ最小值（lambda.min=0.051 7），建立基于Riskscore = （0.004 6）×THBD+（0.416 9）×CTSD+（0.082 2）×FAH的预后风险模型（图5A、5B）。根据中位风险评分，患者被分为高风险组和低风险组。风险评分和生存状态的分布显示，两组之间存在差异（P= 0.001 62），且高风险组中这3个基因的表达水平更高（图5C）。在生存分析中，高风险组患者的总生存期短于低风险组患者（HR = 1.79，P = 0.001 62；图 5D）。 ROC曲线分析证实了该模型的预测准确性，1年生存率的AUC值0.725，3年生存率的AUC值为0.698（图 5E）。

对TISCH数据库的3个与GBM相关的单细胞RNA测序数据集GSE131928、GSE139448和GSE162631进行分析，以评估肿TME中CTSD、FAH和THBD的表达情况。在包含8种主要细胞类型的 GSE131928 数据集中，CTSD、FAH和THBD在这些细胞类型中均有表达（图 6A）。在包含4种细胞类型的 GSE139448数据集中，CTSD和FAH主要在恶性细胞和免疫细胞中富集，而THBD的表达相对较弱（图6B）。在包含5种主要细胞类型的 GSE162631 数据集中，CTSD、FAH和THBD均在恶性细胞和免疫细胞群中表达（图6C）。图7进一步展示了3个数据集中这些基因在不同细胞类型中的水平。CTSD 在一些恶性细胞和巨噬细胞簇中持续高表达，FAH在单核/巨噬细胞、肥大细胞中高表达，而THBD则主要在内皮细胞和单核/巨噬细胞中富集。

TIMER数据库研究了GBM中预后基因表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性。CTSD表达与肿瘤纯度、CD8⁺ T细胞呈负相关（P<0.05），与CD4⁺ T细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈正相关（P<0.05，图8A）。FAH表达与肿瘤纯度和CD8⁺ T细胞呈负相关（P<0.05），与CD4⁺ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈正相关（P<0.05）（图8B）。类似地，THBD 的表达与肿瘤纯度和CD8⁺ T 细胞呈负相关（P<0.05）；与中性粒细胞和树突状细胞呈正相关（P<0.05）（图8C）。这些结果表明3个预后基因（CTSD、FAH和THBD） 与 GBM 微环境中的免疫浸润相关。

为了探索FAH的临床相关性，使用TCGA数据集检测了其在不同GBM患者亚组中的表达情况。FAH在原发性GBM组织中的表达高于正常脑组织（P<0.001，图9A）。分年龄层分析结果表明，FAH在不同年龄组（21~40、41~60、61~80和>80岁）中持续上调（P<0.05，图9B）。此外，与正常组织相比，男性和女性GBM患者的FAH表达均升高（P<0.001），而男性和女性GBM患者中FAH的表达并无明显差异（图9C）。TP53 突变组和 TP53 非突变组的 FAH 表达水平均高于正常样本（P<0.001），且TP53 突变肿瘤中的 FAH 表达最高（P<0.05，图9D）。HPA数据库中的免疫组化分析进一步证实，与正常脑组织相比，GBM组织中FAH蛋白表达增加（图9E）。这些结果表明，FAH在GBM中高表达，并可能与肿瘤进展相关。

years， 61-80 years， and >80 years）； C： FAH expression in male and female patients and normal tissue； D： FAH expression in GBM tissue with and without TP53 mutations； E： Representative IHC images showing FAH protein expression in normal brain and GBM tissue； ^*P<0.05， ^***P<0.001 vs Normal group； ^#P<0.05 vs TP53-mutant group； ^&&P<0.01 vs 21 - 40 years group； ^ΔP<0.05 vs 41-60 years group.

为了验证FAH在GBM中的致癌潜力，体外细胞实验中通过qPCR和Western blot分析了FAH的表达。结果显示，与正常人星形胶质细胞 （NHA）相比，GBM细胞系中的FAH表达升高，尤其是在U87和T98G细胞的表达最高（P<0.05，图10A-10C）。使用慢病毒shRNA沉默了U87和T98G细胞中的FAH表达后，qPCR 和 Western blot均证实FAH在mRNA和蛋白质水平上被有效敲低（P<0.05，图10D-10F）。CCK-8检测结果显示，与shNC组相比，shFAH组U87和T98G细胞的的增殖活性降低，两组之间差异具有统计学意义（P<0.001，图10G、10H）。同样，Transwell实验表明，shFAH组的迁移和侵袭数量少于shNC组，差异有统计学意义（P<0.05，图11A-11D）。上述结果提示，FAH表达下调与GBM细胞增殖及迁移侵袭能力的降低有关。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是GBM发生发展的核心驱动因素。 该通路的激活与GBM不良预后显著相关，其下游分子（如磷酸化Akt、mTOR）可作为潜在预后标志物。为了探究FAH介导致癌作用的分子机制，通路富集分析显示FAH表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路激活呈正相关（相关系数r=0.409，P=1.54e-07；图12A）。与此预测一致，Western blot分析显示，与shNC组相比，shFAH组GBM细胞中p-PI3K、p-AKT、p-4EBP1和p-S6水平降低（P<0.05），而这些分子的总蛋白水平保持不变（图12B-12F）。这些结果表明，FAH至少部分通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来促进GBM进展。

为了进一步验证FAH在体内的致癌作用，使用稳定转染shFAH或shNC的U87细胞建立了异种移植小鼠模型。与shNC组相比，FAH沉默细胞组的肿瘤生长速度明显减慢（图13A）。定量分析显示，shFAH组的肿瘤质量和肿瘤体积均小于shNC组（P<0.001，图13B、13C）。这些结果证明了沉默FAH在体内抑制GBM的肿瘤生长。