金黄色葡萄球菌USA300-R菌株（ATCC BAA-1566），属于ST8分型、MRSA菌株，对甲氧西林和四环素等多种抗生素耐药，由陆军军医大学饶贤才教授馈赠。

以SPF级C57BL/6J小鼠（6~8周龄，雌性）作为野生型小鼠（wild type， WT），购自北京斯贝福实验动物技术有限公司。SPF级Il17a^-/- C57BL/6J小鼠（6~8周龄，雌性），购自江苏集萃药康生物科技有限公司。本实验已通过军事医学研究院微生物流行病研究所动物实验伦理审查委员会批准，批号：IACUC-DWZX-2025-A013。动物饲养及感染均在军事医学研究院动物中心完成，按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

脑心浸润液培养基（brain heart infusion broth， BHI，英国Oxoid生物公司）；琼脂糖（翌圣生物科技股份有限公司）；血琼脂平板（北京陆桥技术有限责任公司）；泊洛沙姆（美国Sigma-Aldrich生物公司）；3%过氧化氢、75%乙醇（山东安捷高科消毒科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline， PBS，天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；0.9%氯化钠注射液（山东华鲁制药有限公司）；鼠尾鉴定试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）酶预混液（北京博迈德基因技术有限公司）；PCR引物（北京天一辉远生物科技有限公司）；核酸凝胶染料（北京擎科生物科技股份有限公司）；50× TAE电泳缓冲液（江苏康润生物科技有限公司）；Mouse IL-17A ELISA KIT（北京索莱宝科技有限公司）；RNA快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司）；HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。生物安全柜（美国Nauire公司，型号：NU-440-44E）；细菌震荡培养箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：HZQ-F160）；高通量水平电泳槽（上海翌圣生物科技股份有限公司，型号：MiniPro^TM EpBasic）；紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司，型号：UV-8000A）；液体气溶胶肺递送装置（北京慧荣和科技有限公司，型号：MKC22524）；立式低温高速离心机（日本Hitachi Koki有限公司，型号：CR22N）；电子天平（苏州培科实验室仪器科技有限公司，型号：WTC 2000）；微量分光光度计（型号：NanoDrop2000）、PCR仪（型号：ABIProFlex）、成像系统（型号：iBright CL750）、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction， RT-qPCR）系统（型号：Applied Biosystems 7300）（美国赛默飞世尔科技公司）。

将-80 ℃保存的甘油菌种以1∶1 000的比例接种于20 mL的BHI肉汤中，置于37 ℃振荡（220 r/min）培养14 h，直至细菌生长至平台期，600 nm处吸光度（absorbance， A）A_{600 nm}>2.6，作为第1代菌。随后，取第1代菌以1∶200的比例接种于20 mL BHI肉汤中，继续在37 ℃振荡（220 r/min）培养3.5 h，此时菌液A_{600 nm} ≈ 1.5，作为第2代菌。接着，将第2代菌以1∶200的比例接种于BHI肉汤中，继续在37 ℃振荡（220 r/min）培养3.5~4 h，直至菌液A_{600 nm} = （1.8~2.0）值，此为第3代菌。收集第3代菌液至无菌1.5 mL离心管，4 000 r/min，离心10 min，弃去上清液，用适量含0.05%泊洛沙姆0.9%氯化钠注射液重悬，调整菌液A_{600 nm}= 1.8。最后将A_{600 nm} ≈ 1.8的菌液浓缩至3倍，此时菌落计数约为1×10⁸菌落形成单位（colony forming unit， CFU），作为后续感染小鼠的剂量^［11］。

基于基因表达综合库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中高耐药且高毒力金黄色葡萄球菌USA300-R小鼠急性吸入性肺炎模型的肺组织RNA-seq数据集GSE220943^［12］，采用基因表达量标准化指标（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads， FPKM值）评估模型中IL-17家族关键基因的表达水平。肺炎模型由USA300-R菌株以1×10⁸ CFU（亚致死剂量）经液体气溶胶肺递送途径攻毒^［13］WT小鼠而得，感染0~24 h为急性炎症期，24~48 h为炎症恢复期，48~96 h为损伤修复期。RNA-seq数据集包括感染后0、12、24、48、96 h共5个时间点的肺组织样本测序结果，每个时间点含3份肺组织样本。

USA 300-R菌株以1×10⁸ CFU剂量（50 μL）经液体气溶胶肺递送途径攻毒^［13］9只WT小鼠，分别在感染后0、12、24 h取3只小鼠的肺组织，使用RNA快速提取试剂盒获得该小鼠肺组织总RNA，根据RT-qPCR试剂盒说明书进行相关RT-qPCR操作，每只小鼠设置3个复孔。鉴定Il17a基因所用RT-qPCR引物为：正向引物，5′-GTCCTTCCATTCTCTGATGCAC-3′；反向引物，5′-GGATGCTTCCTCTACCAGCC-3′。β-actin内参所用引物为：正向引物，5′-GGC TGTATTCCCCTCCATCG-3′；反向引物，5′-CCAGT TGGTAACAATGCCATGT-3′。RT-qPCR体系为：5 μL 2× One Step SYBR Green Mix、0.5 μL One Step SYBR Green Enzyme Mix、Primer F和Primer R各0.5 μL、0.2 μL Dye Ⅱ、1 μL RNA template，最后ddH₂O补足体积至10 μL。RT-qPCR反应条件：50 ℃逆转录180 s，95 ℃预变性30 s，40次循环反应（95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s），熔解曲线解析（95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，熔解：从60 ℃缓慢、连续升温至95 ℃，并在此过程中持续采集荧光信号）。

USA 300-R菌株以1×10⁸ CFU剂量（50 μL）经液体气溶胶肺递送途径攻毒^［13］30只WT小鼠，分别在感染后0、12、24 h各取10只小鼠，对小鼠进行肺泡灌洗操作，使用小鼠IL-17A ELISA试剂盒检测BALF中IL-17A蛋白表达水平。

对Il17a^-/-基因敲除小鼠进行鉴定，并设置WT小鼠作为对照。根据鼠尾鉴定试剂盒说明书配制消化液，剪取约2 mm鼠尾浸泡在消化液中，使用PCR仪，将消化液在55 ℃下孵育15 min、95 ℃下孵育5 min后，加入终止液，吸取上清即为提取的小鼠基因组DNA。使用微量分光光度计测定DNA浓度后，对两种小鼠鼠尾提取基因组样本进行PCR扩增，同时设置空白对照，以鉴定Il17a基因是否敲除成功。体系①为鉴定Il17a基因所用第1对PCR引物（F1R1）：正向引物，5′-TGCTCTGCACTCGTATTCTCATG-3′；反向引物，5′-ACATATCCAGCAGGATGCTTCC-3′。体系②为鉴定Il17a基因所用第2对PCR引物（F2R2）：正向引物，5′-AGCTCAGCGTGTCCAAACAC-3′；反向引物，5′-CCCTGCTCTATCCAAGAACTCTG-3′。β-actin内参：正向引物，5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；反向引物，5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。PCR体系为：15 μL 2× Taq pre-mix、Primer F和Primer R各0.5 μL、0.2 μL Dye Ⅱ、3 μL DNA template，最后ddH₂O补足体积至30 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性180 s，95 ℃变性30 s，72 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最终延伸10 min。PCR结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，上样量为5 μL，110 V电泳30 min。

USA300-R菌株以1×10⁸ CFU剂量（50 μL）经液体气溶胶肺递送途径攻毒^［13］WT小鼠和Il17a^-/-小鼠各12只，感染后0、12、24 h每组处死4只，制备肺组织匀浆，取10 μL梯度稀释后的溶液滴血琼脂平板，37 ℃培养箱中培养16~24 h后进行菌落计数。

攻毒和分组方法同上，感染后0、12、24 h每组处死4只，取整肺浸泡在4%组织固定液48 h后，由武汉赛维尔生物科技有限公司完成样本包埋、石蜡切片及苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining， HE）染色。在光学显微镜下观察肺组织病理变化，进行病理损伤评分。采用Smith评分方法^［14］对肺水肿、肺泡以及间质炎症、肺泡及间质出血、肺不张和透明膜形成，分别进行0~4分半定量分析：无损伤，0分；病变范围<25%，1分；病变范围占25%~50%，2分；病变范围占50%~75%，3分；病变>75%至满视野，4分；总肺损伤评分为上述各项之和。每只动物观察10个高倍镜视野，取其平均值。

USA300-R菌株以2×10⁸ CFU剂量（半数致死剂量，50 μL）经液体气溶胶肺递送途径攻毒WT小鼠和Il17a^-/-小鼠各10只，观察并记录感染后7 d内小鼠的生存情况和体质量变化趋势。