基金项目: 国家自然科学基金资助项目(编号:30872246,30872405);; 上海市基础研究重点项目(编号:08JC1405200);; 国家“863”项目(编号:2006AA02A238);; 安徽省自然科学基金项目(编号:080413136)
作者：李存枚;潘卫;曹洁;王锦红;黄德圣;庞强;廖文婷;邓松华;
关键词：HIV-1/遗传学;;大肠杆菌/遗传学;;基因产物,tat基因表达
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2009.01.002
〔摘 要〕 目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。