基金项目: 安徽省高校自然科学研究项目(编号:KJ2020A0180); 安徽省教育厅省级研究生学术创新项目(编号:2022xscx059);安徽省教育厅省级研究生教育教学改革研究项目(编号:2022jyjxggyj226); 安徽省卫生健康科研项目(编号:AHWJ2023A20229); 安徽医科大学第二附属医院首批国家自然科学基金孵育计划(编号:2019GQFY04);安徽医科大学第二附属医院第四批科技新星培优项目(编号:2018KA08); 2020年高校优秀青年骨干人才国外访学研修项目(编号:gxgwfx2020024);
作者:吴赛男;齐晓暄;杨雅淳;熊丹瑜;林步云;张青
关键词:Card9;烟曲霉菌;巨噬细胞;炎症因子;角膜炎;
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2025.03.009
〔摘 要〕 目的 研究胱天蛋白酶募集域蛋白9(Card9)在烟曲霉性角膜炎中的作用,以及Card9缺乏对巨噬细胞抵御真菌感染的影响。方法(1)选择6~8周的C57BL/7小鼠,分别用Card9 siRNA和Blank siRNA进行预处理,通过Western blot和RTPCR检测各组Card9的表达;siRNA预处理72 h后刮去角膜上皮,注射烟曲霉孢子悬液,在感染后第1、3、5、7天记录角膜评分,通过RT-PCR、免疫组化检测法(IHC)检测各组Card9、核因子κB (NF-κB)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达;(2)体外培养人角膜上皮细胞(HCECs)、人单核巨噬细胞(THP-1细胞),使用RT-PCR检测两种细胞的Card9基因的表达;使用shRNA载体对THP-1细胞构建稳转细胞系,通过Western blot和RT-PCR检测Card9的表达,诱导成巨噬细胞,烟曲霉刺激后用RT-PCR检测Card9、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。结果 小鼠烟曲霉性角膜炎中Card9表达增加,主要分布在免疫细胞的细胞质中;使用Card9 siRNA处理后的小鼠角膜中Card9表达明显减少;在抑制Card9基因的表达后,IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的表达明显减少,其中以IL-1β的变化最为显著。体外实验中,HCECs中几乎不表达Card9,而THP-1细胞中大量表达;诱导后的巨噬细胞在烟曲霉刺激下,Card9、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α均显著上调,抑制Card9表达后,刺激后的表达明显减少,以IL-1β的变化最为显著。结论 Card9参与烟曲霉性角膜炎的炎症发展及愈合过程,Card9缺乏可引起巨噬细胞功能受损,并抑制炎症因子表达,其中IL-1β的影响最大。