基金项目: 国家自然科学基金青年基金(编号:81201368)
作者:邢雪梅;耿慧武;潘林鑫;刘泽宇;姚亮;邓欢欢;刘晓颖;范礼斌;
关键词:EBI3;;质粒构建;;Western blot;;免疫荧光
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.005
〔摘 要〕 目的研究人EB病毒诱导的基因3(EBI3)及其突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位差异及其原因。方法基于NCBI数据库中人EBI3氨基酸的序列分析,利用分子克隆技术构建人EBI3真核表达质粒pc DNA3.1-EBI3-FLAG、单独包含氨基端或羧基端Ⅲ型纤连蛋白(FN3)结构域的缺失突变体的表达质粒pc DNA3.1-EBI3(1~135)-FLAG和pc DNA3.1-EBI3(125~230)-FLAG以及第210位天冬氨酸(Asp)点突变体Asp210的表达质粒pc DNA3.1-EBI3-D210AFLAG;Western blot方法检测EBI3及其突变体在HEK 293T细胞中的表达;免疫荧光实验观察人EBI3及各突变体在COS7细胞中的定位。结果成功构建了下游携带FLAG标签的人EBI3及其突变体的真核表达质粒;Western blot结果显示重组蛋白均能在HEK 293T细胞中稳定表达;经激光共聚焦显微镜观察,EBI3及其缺失突变体在COS7细胞的表达位置发生明显变化。结论人EBI3及其突变体真核表达质粒均能在HEK 293T、COS7细胞中成功表达;人EBI3缺失突变体在COS7细胞中的定位发生明显变化,氨基端结构域可能在EBI3蛋白的正确定位中发挥重要作用;EBI3蛋白的第210位Asp的突变影响了其在细胞内的定位。