基金项目: 国家自然科学基金(编号:30873046、30973424、81072663);; 安徽省留学回国人员科研项目(编号:2009-2011);; 安徽省学科学术带头人基金;; 安徽省博士点基金
作者：胡中倩;汪心怡;李菲菲;储著朗;邢小翠;李娟;查欣;瞿成奎;汪思应;
关键词：SHP-2;;蛋白酪氨酸磷酸酶;;真核表达;;突变
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2012.07.004
〔摘 要〕 目的构建pcDNA3.1 SHP-2野生型(WT)及SHP-2D61G突变型(MT)真核表达载体,为研究SHP-2激活突变对肿瘤恶性生物学行为的影响提供基础。方法用RT-PCR及定点突变法从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1SHP-2野生型及SHP-2D61G/+真核表达质粒,经酶切、测序检测其构建的准确性;Western blot法检测转染NIH3T3细胞中SHP-2蛋白的表达水平;免疫共沉淀法获得表达在NIH3T3细胞中的SHP-2蛋白,用pNPP法检测其磷酸酶活性。结果构建的pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G突变质粒经酶切初步检测后,测序检测发现MT SHP-2在181位核苷酸由WT的G突变为T,转染NIH3T3细胞株能够表达SHP-2蛋白;且转染MT的NIH3T3细胞株内SHP-2磷酸酶活性较WT组升高2倍(P<0.01)。结论成功构建了pcDNA3.1SHP-2野生型及SHP-2D61G突变型真核表达载体,SHP-2D61G突变的蛋白磷酸酶活性升高。