基金项目: 国家自然科学基金(编号：82104187、82173824、81973332);;安徽省自然科学基金(编号：2108085QH382);;中国博士后科学基金(编号：2021T140002、2021M700184);;安徽省博士后研究人员科研活动经费资助项目(编号：2020B430)
作者：蒋励萍;陈露颖;蒯佳婕;王凤玲;李浩;关艳玲;马旸;韩陈陈;魏伟;
关键词：G蛋白偶联受体激酶2;;HEK 293T细胞;;真核表达;;蛋白纯化;;活性鉴定
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2023.02.001
〔摘 要〕 目的 构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法 设计引物，以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板，PCR扩增His-GRK2目的基因，将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上；将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细胞，48 h后采用Western blot法检测GRK2蛋白表达，通过镍螯合的磁珠法纯化GRK2蛋白，考马斯亮蓝染色和Western blot法检测GRK2蛋白纯化，His pull down检测GRK2蛋白活性。结果 双酶切和测序鉴定结果表明，pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒成功构建；Western blot法检测结果表明，GRK2蛋白的分子量约为80 ku,提示GRK2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达(t=6.433,P=0.003);通过镍螯合的磁珠纯化得到GRK2蛋白，His pull down实验结果表明GRK2与前列腺素E2受体4亚型(EP4)结合，提示GRK2蛋白具有生物学活性(t=13.5,P=0.000 2)。结论 pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒的序列测序正确，成功构建GRK2重组质粒，GRK2重组质粒在真核细胞HEK 293T的细胞中成功表达且表达的蛋白具有生物学活性。