〔摘　要〕 目的 利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法 构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒，将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达，对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用；利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性；对本检测方法的条件进行优化；ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_m与K_(cat)值。结果 重组表达质粒构建成功，通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带，对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右，命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定，结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段，不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到：设定滤光片灵敏度在65～110之间；实时动态检测间隔为2 min/次，动态检测时间为30～120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5～32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右，最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s~(-1)和K_m为(2.33±0.21)μmol/L。结论 成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。