〔摘　要〕 目的 制备双催化三联体聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶（PETase），并评价其对PET的生物降解效果。方法 基于PETase晶体结构分析，通过点突变方式（T88H/L117D）引入突变位点，并利用原核表达和层析纯化技术制备双催化三联体PETase重组蛋白，相对定量产物对苯二甲酸单羟乙基酯（MHET）和对苯二甲酸（TPA）来观察其对PET底物的酶解反应。结果野生型和突变型PETase均以包涵体形式在大肠埃希菌中高效表达，约占菌体总蛋白20%。经尿素变性处理后，通过亲和层析纯化，目的蛋白主要存在于300 mmol/L咪唑洗脱液中，其浓度和纯度分别为1.824 mg/mL和83.11%（野生型）、1.833 mg/mL和84.32%（突变型）。进一步的离子交换层析纯化显示，目的蛋白主要存在于200 mmol/L NaCl洗脱液中，其浓度和纯度分别为2.776 mg/mL和96.86%（野生型）、1.967 mg/mL和95.13%（突变型）。透析复性后，野生型和突变型PETase的浓度分别为0.484 mg/mL和0.991 mg/mL。酶活性检测显示，与野生型PETase相比，突变型的MHET的产率为（237.67±17.00）%,TPA的产率为（197.33±12.01）%。结论 经过原核表达和层析纯化技术获取了T88H/L117D双催化三联体PETase，其具有增强的PET降解能力，为PET的生物降解提供新的思路。