基金项目: 国家自然科学基金(编号：82201804);;安徽省自然科学基金(编号：2208085QH235);;安徽高校科学研究项目(编号：KJ2021A0217);;安徽医科大学校科研基金(编号：2021xkj007);安徽医科大学“早期接触科研”训练计划项目(编号：2021-ZQKY-149、2022-ZQKY-219)
作者：蔡睿;张浩;刘壮;陈远华;谢芬芬;洪强;
关键词：SOX3;;卵巢颗粒细胞;;慢病毒载体;;增殖;;雌二醇;;绿色荧光蛋白
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2024.03.001
〔摘 要〕 目的 研究性别决定区Y框蛋白3(SOX3)对人卵巢颗粒细胞(KGN)增殖和雌二醇分泌的影响。方法 在NCBI数据库Gene-Bank中搜索人SOX3(NM＿005634.3)的基因序列，用PCR方法扩增目的基因SOX3,将其克隆到慢病毒载体pLV-EF1a-GFP-2A-Puro上，获得过表达慢病毒重组质粒pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3;将测序正确的过表达慢病毒重组质粒以及包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共同转染到人胚肾细胞系(HEK 293T)细胞中(pLV-SOX3组),将pLV-EF1a-GFP-2A-Puro及包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共同转染到HEK 293T细胞中(pLV-NC组),转染48 h后收集两组慢病毒颗粒并测定病毒的滴度，将两组慢病毒感染KGN细胞，经嘌呤霉素筛选2周后，获得稳定表达的细胞系；采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测两组中SOX3的mRNA和蛋白水平；CCK-8法检测两组细胞增殖能力；ELISA测定两组雌二醇的浓度。结果 PCR产物的鉴定和测序结果表明SOX3基因片段扩增成功，酶切和测序结果表明过表达慢病毒重组质粒构建完成；慢病毒感染HEK 293T细胞后可检测到绿色荧光，表明慢病毒包装成功；慢病毒感染KGN细胞后经嘌呤霉素筛选，荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光；RT-qPCR和Western blot检测结果均表明pLV-SOX3组中SOX3表达水平高于pLV-NC组(P