基金项目: 国家自然科学基金(编号:81760556);;贵州省科技计划项目(编号:黔科合基础[2016]1118);;贵州省科技合作计划项目(编号:黔科合LH字[2015]7318);;贵州医科大学2018年度学术新苗培养及创新探索专项项目(编号:黔科合平台人才[2018]5779-55);;贵阳市科技计划项目(编号:筑科合同[20161001]40、筑科合同[2017]5-27号);;贵州省卫生健康委科学技术基金项目(编号:gzwjkj2019-1-041);;国家级大学生创新创业训练计划项目(编号:20195200134)
作者：陈鹤丹;林煊;谢颖;陈尧;杨君仪;王赟;张世超;胡祖权;曾柱;刘丽娜;
关键词：MAGE-A3;;体外转录mRNA;;蛋白表达
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2020.08.002
〔摘 要〕 目的构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得MAGE-A3 mRNA,在哺乳动物细胞NIH/3T3中表达MAGE-A3蛋白。方法通过逆转录PCR从三阴型乳腺癌细胞系4T1中扩增得到MAGE-A3编码基因,插入到载体pcDNA3.1(+)中,成功构建重组表达载体pcDNA3.1-MAGE作为体外转录RNA的模板。利用T7体外转录试剂盒获得MAGE-A3 RNA,添加poly(A)尾后进行mRNA纯化。将纯化后的MAGE-A 3 mRNA转染到NIH/3T3细胞中,Western blot实验检测MAGE-A3蛋白的表达。结果 pcDNA3.1-MAGE-A3正确表达和构建。体外转录MAGE-A3 mRNAA_(260)/A_(280)为1.92,浓度是872.3 ng/μl,长度约为500 bp。转染MAGE-A3 mRNA后,NIH/3T3能表达大小约35 ku的MAGE-A3蛋白。结论成功构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得纯度较高的MAGE-A3 mRNA,该mRNA能在NIH/3T3细胞中表达MAGE-A3蛋白。