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鼠源pEGFP-C1-TMEM88真核表达质粒的构建及其功能研究

安徽医科大学学报 2019 12 v.54 1865-1870     字体:

基金项目: 国家自然科学基金(编号:81700522);;安徽省自然科学基金(编号:1808085MH235)

作者:李良云;潘林鑫;杨俊发;胡爽;张濛;李俊;徐涛;

关键词:pEGFP-C1-TMEM88;;RAW264.7细胞;;增殖;;凋亡;;白细胞介素-6;;肿瘤坏死因子-α

DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2019.12.006

〔摘 要〕 目的构建鼠源真核表达载体pEGFP-C1-跨膜蛋白88质粒(pEGFP-C1-TMEM88),并观察其对RAW264.7细胞中炎症因子分泌的影响和对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法在小鼠正常肝细胞株(AML-12)中提取RNA并且逆转录为cDNA,同时将引物稀释到10μmol/L,其余作为储备液。采用PCR技术扩增跨膜蛋白88(TMEM88)并鉴定,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收。再对PCR产物及载体进行酶切回收,酶切片段连接后,进行连接产物的转化、挑菌、摇菌、质粒抽提。酶切鉴定后,送至测序鉴定。将构建好的质粒转染至小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7细胞中,通过MTT实验和流式细胞术检测其对细胞增殖和凋亡的影响,并用ELISA技术检测炎症因子:白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在RAW264.7细胞中的表达。结果测序结果显示pEGFP-C1-TMEM88真核表达质粒构建成功;MTT实验结果显示:48 h后过表达TMEM88组细胞的增殖率为(0.71±0.04),显著低于对照组(0.94±0.06)(F=21.55,P<0.01);流式细胞术结果显示:过表达TMEM88组细胞的凋亡率为(11.52±1.43)%,显著高于对照组(7.78±1.67)%(F=10.07,P<0.05);ELISA检测结果显示:转染pEGFP-C1-TMEM88质粒后的RAW264.7细胞中的IL-6、TNF-α表达较对照组升高。结论 TMEM88能够显著抑制RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡,TMEM88在RAW264.7细胞中炎症因子IL-6、TNF-α的表达升高,为进一步了解TMEM88的功能奠定了基础。