基金项目: 安徽省科技厅重点研究与开发计划项目(编号:1804h08020236);;安徽省高校自然科学研究项目(编号:KJ2018A0206)
作者:潘正兰;管世鹤;陈礼文;杨凯;张浩;段元丽;王兆飞;王秀;侯舒文;
关键词:白介素-6;;慢病毒表达载体;;稳定转染;;乙肝表面抗原;;乙肝e抗原;;乙肝病毒DNA
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2019.04.019
〔摘 要〕 目的构建白介素-6(IL-6)过表达慢病毒稳转细胞系,探讨其对乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)表达的影响。方法以Huh7细胞gDNA为模板,通过PCR技术扩增获得IL-6片段并克隆到pMIGR1载体上,测序鉴定正确后,分别用pMIGR1质粒和pMIGR1-IL-6质粒与慢病毒包装质粒pCL-10A1共转染293T细胞,获得重组慢病毒颗粒,分别感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出成功表达目的质粒的阳性细胞,分别命名为Huh7/con和Huh7/IL-6,电化学发光法检测细胞培养上清液中IL-6表达水平;qRT-PCR技术检测细胞中IL-6 mRNA表达水平;化学发光微粒子免疫检测法检测HBsAg、HBeAg表达水平,PCR-荧光探针法检测HBV-DNA表达水平。结果通过测序验证成功构建pMIGR1-IL-6质粒;通过慢病毒介导成功筛选出Huh7/con和Huh7/IL-6细胞系;电化学发光法及qRT-PCR结果显示,与对照组Huh7/con细胞系比较,Huh7/IL-6细胞系培养上清液IL-6水平及细胞中IL-6 mRNA水平显著升高;pcDNA1.3质粒转染Huh7、HepG2、Huh7/IL-6细胞6、12、24、48 h后上清液中IL-6表达水平显著升高;20 ng/ml IL-6处理pcDNA1.3质粒转染后的Huh7和HepG2细胞6、12、24、48 h后上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平显著下降;pcDNA1.3质粒转染Huh7/IL-6细胞6、12、24、48 h后上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平显著下降。结论成功构建IL-6慢病毒表达载体,并建立稳定过表达IL-6的Huh7细胞系;pcDNA1.3质粒转染可使IL-6表达上调;IL-6可使HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平下降。