基金项目: 国家自然科学基金青年基金(编号:81201368)
作者:沙启飞;潘林鑫;耿慧武;王梦媛;印叶盛;李子剑;刘晓颖;范礼斌;
关键词:CLIC1;;质粒构建;;免疫荧光;;Western blot
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.12.002
〔摘 要〕 目的构建胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)点突变体的真核表达质粒,进行CLIC1突变体的表达、定位及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)的共定位研究,为进一步揭示其功能奠定基础。方法以CLIC1全长c DNA序列为模板,构建3个真核表达质粒即pc DNA3.1-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG;Western blot法检测CLIC1及其点突变体在HEK 293T细胞中的表达;免疫荧光技术了解CLIC1及其点突变体蛋白在COS7细胞中的定位及与Sedlin的共定位情况。结果成功构建了CLIC1点突变体的真核表达质粒;Western blot结果显示3个点突变体蛋白在HEK293T细胞中均能表达,突变体的分子量低于野生型的;免疫荧光实验表明CLIC1蛋白在细胞质和细胞核都有表达,但主要在细胞核。CLIC1点突变体蛋白定位在胞质中,细胞核中无分布,与Sedlin蛋白在胞质存在共定位。结论CLIC1的3种点突变体均能在哺乳动物细胞中有效表达;CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白均存在共定位,提示两种蛋白之间可能存在相互作用。