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FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

安徽医科大学学报 2012 10 v.47 1165-1168     字体:

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(项目:30960119);; 江西省科技支撑计划项目(项目:2010BSA12000)

作者:王慧方;郑振中;

关键词:慢病毒载体;;RNA干扰;;FGL2基因

DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2012.10.005

〔摘 要〕 目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。