安徽医科大学学报
2012 04 v.47 361-364
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基金项目: 安徽省教育厅自然科学重点科研项目(编号:KJ2010A187);; 安徽省自然科学基金(编号:11040606M170,11040606M164)
作者：耿慧武;刘君;陈应炉;杨军;刘晓颖;范礼斌;
关键词：cystatinB;;细胞定位;;转染;;免疫荧光
DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2012.04.002
〔摘 要〕 目的用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人cystatinB真核表达载体,用其转染COS-7和HEK 293 T细胞观察cystatin B在增殖细胞内的定位;转染HEK 293 T细胞检测其表达。方法设计带FLAG-tag的引物,以人cystatin B全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增cystatin B全长序列,然后插入pCDNA 3中构建pCDNA 3-cystatin B-FLAG(CSTBF)质粒;脂质体法转染至COS-7、HEK 293 T细胞,荧光显微镜下观察其在细胞内定位;转染至HEK 293 T细胞,提取细胞总蛋白进行Western blot。结果正确构建了pCD-NA 3-cystatin B-FLAG质粒;定位实验表明在COS-7和HEK293 T细胞中,cystatin B主要分布在细胞核内,核膜处更集中,胞浆内也有广泛分布;Western blot结果表明该质粒能在细胞中有效表达。结论该研究结果为了解cystatin B在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础。