基金项目: 国家自然科学基金(编号:82170484);;安徽省重点研究与开发项目(编号:202004b11020025)
作者:武冬青;但章勇;何晓燕;朱华庆;
关键词:细胞膜;;纳米囊泡;;Cas9-RNP;;内吞;;基因敲低
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2023.03.001
〔摘 要〕 目的 通过使用小鼠巨噬细胞膜包裹Cas9核糖核蛋白复合物(RNP),制备Cas9-RNP仿生纳米粒Cas9-RNP@MMs,旨在利用此仿生纳米粒递送Cas9-RNP复合物用于基因编辑,并进一步在体外研究小鼠巨噬细胞RAW264.7对Cas9-RNP@MMs的内吞情况及其基因编辑效果,为开发低毒性的抑制NLRP3治疗靶点的仿生纳米粒载体提供证据。方法 将提取的小鼠巨噬细胞细胞膜与制备的Cas9-RNP混合,超声后使用脂质体挤压仪挤压得到Cas9-RNP@MMs。使用纳米颗粒跟踪仪检测Cas9-RNP@MMs的颗粒直径,透射电子显微镜下观察Cas9-RNP@MMs的颗粒形态。激光共聚焦荧光显微镜成像分析细胞对Cas9-RNP@MMs的内吞情况。采用MTT法检测Cas9-RNP@MMs生物相容性。通过qPCR和Western blot检测NLRP3表达,来验证Cas9-RNP@MMs敲低NLRP3基因的效果。结果 采用巨噬细胞细胞膜制备的Cas9-RNP@MMs平均粒径约为216 nm;激光共聚焦荧光显微镜下,Cas9-RNP@MMs能成功被RAW246.7细胞摄取;MTT检测结果显示Cas9-RNP@MMs处理的小鼠巨噬细胞RAW246.7具有良好的生物相容性;qPCR和Western blot检测显示,有两条NLRP3特异的向导RNA(sgRNA)通过Cas9-RNP@MMs介导,有良好的敲低NLRP3基因表达的效果。结论 利用仿生纳米粒成功制备了内腔载有Cas9-RNP复合物的纳米级囊泡Cas9-RNP@MMs, Cas9-RNP@MMs具有良好的生物相容性并且可以被RAW246.7细胞高效内吞;含有NLRP3特异的sgRNA的Cas9-RNP@MMs能够特异性敲低NLRP3基因表达。