基金项目: 国家自然科学基金(编号:81271837);;安徽高校自然科学研究项目(编号:KJ2012A161);;安徽省自然科学基金(编号:1708085MH193)
作者:周畅;许常青;许方玮;方圆;陈伟;文志;林康;王林定;
关键词:卡波肉瘤相关疱疹病毒;;K15P;;K15P(YF);;慢病毒;;EA.hy926
DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2019.11.021
〔摘 要〕 目的包装包含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV) K15P及其突变体K15P(YF)基因的慢病毒颗粒,并对此基因在EA.hy926细胞内稳定表达进行研究。方法通过PCR方法扩增获得KSHV K15P、K15P(YF)基因片段,使用限制性内切酶Not I与BamH I酶切和TA克隆法构建T载体与慢病毒表达载体pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro,通过lip2000将构建好的慢病毒表达载体与两种辅助包装质粒PSPAX2和pMD2.g共转染HEK 293T细胞,48 h后收集慢病毒。慢病毒感染EA.hy926细胞并通过嘌呤霉素筛选稳定表达株,Western blot检测K15P与K15P(YF)蛋白的表达。Transwell与CCK8实验检测K15P对内皮细胞的增殖迁移影响。结果成功构建慢病毒表达载体,筛选出稳定表达K15P、K15P(YF)蛋白的EA.hy926细胞。在EA.hy926细胞Transwell迁移实验中,与空载体组和K15P突变体组(0.98±0.23)比较, K15P组(2.25±0. 15)的EA. hy926细胞的迁移能力明显增强(P <0. 01),三组细胞迁移量差异有统计学意义(F=113. 5,P <0. 01);CCK8增殖活性实验中,与空载体组和K15P(YF)组(109. 23±12. 58)比较,K15P组(138. 69±7. 47)的EA. hy926细胞的增殖能力明显增强(P <0. 01),三组细胞增殖活性差异有统计学意义(F=40. 78,P <0. 01)。结论 K15P蛋白增强了内皮细胞的增殖与迁移,而K15P(YF)突变体的促进细胞增殖迁移能力减弱,提示K15P蛋白可能在KS的发生发展中参与重要作用。