范蒙蒙,李丛,梁雪,张婉秋,王会平,翟志敏
摘要:
目的通过构建稳定过表达SOX4的人卵巢颗粒细胞(KGN细胞系),探究SOX4对卵巢颗粒细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法利用同源重组法将SOX4(人)基因序列构建到线性化pLV-EF1a-GFP/Puro载体中建立重组慢病毒质粒pLV-EF1a-GFP/Puro-SOX4;将慢病毒表达载体感染人卵巢颗粒细胞(KGN细胞系),以感染pLV-EF1a-GFP/Puro-NC的KGN细胞作为LV-CON组,感染pLV-EF1a-GFP/Puro-SOX4的KGN细胞作为LV-SOX4组,转染后利用嘌呤霉素筛选出稳定表达SOX4的KGN细胞;RT-qPCR和Western blot法检测LV-CON组和LV-SOX4组KGN细胞中SOX4 mRNA和蛋白表达水平;CCK-8实验检测LV-CON组和LV-SOX4组细胞增殖能力;细胞划痕实验检测LV-CON组和LV-SOX4组细胞迁移能力;流式细胞凋亡检测LV-CON组和LV-SOX4组凋亡细胞比例。结果pLV-EF1a-GFP/Puro-SOX4测序结果显示插入基因序列与SOX4的序列完全一致;LV-CON组包装的慢病毒滴度为7×108TU/ml, LV-SOX4组包装的慢病毒滴度为1×108TU/ml;荧光倒置显微镜下观察到重组质粒成功转染至KGN细胞,转染效率达90%以上;RT-qPCR和Western blot检测结果显示:LV-SOX4组KGN细胞中SOX4 mRNA和蛋白表达水平较LV-CON组均明显升高(t=3.10,P<0.05;t=14.20,P<0.05);CCK-8结果显示:LV-SOX4组细胞增殖能力较LV-CON组增强(24 h:t=45.92,P<0.01;72 h:t=25.60,P<0.01);细胞划痕实验结果提示:LV-SOX4组KGN细胞迁移能力较LV-CON组增强(t=7.65,P<0.01);流式细胞凋亡检测显示:LV-SOX4组细胞凋亡比例较LV-CON组减少(t=25.84,P<0.01)。结论成功构建SOX4过表达的人卵巢颗粒细胞(KGN细胞系),SOX4过表达可促进卵巢颗粒细胞增殖、迁移且抑制细胞凋亡。